角膜是位于眼球最前壁的一层透明膜,具有一定的曲率半径,在维持视功能和保护眼球方面发挥了不可替代的重要功能。人角膜由上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层构成,其中,厚度约50μm的上皮层由6-8层人角膜上皮细胞(HCEP细胞)构成,厚度约500μm的基质层由人角膜基质细胞(HCS细胞)和主要由胶原蛋白组成的高度有序的细胞外基质构成,厚度约5μm的内皮层由单层人角膜内皮细胞(HCE细胞)组成。角膜因位于眼表最前端,直接与外界接触,故极易受到损伤和感染,一旦发生病变将会引起角膜混浊、视力下降甚至致盲。目前,临床上治疗角膜病盲的唯一有效手段是角膜移植。但遗憾的是,由于捐献角膜数量的严重不足及捐献角膜老化,致使绝大数角膜病盲患者无法通过角膜移植重见光明。近年来角膜组织工程技术的快速发展,使组织工程角膜的体外构建成为可能,而组织工程角膜作为捐献角膜的等效替代物,则是目前从根本上解决捐献角膜高度匮乏问题、使众多角膜病盲患者恢复视功能的唯一希望。如何获得足量正常的种子细胞和生物相容性理想的载体支架一直是制约组织工程角膜规模化体外构建的两大因素,已成为角膜组织工程领域的研究热点和难点。在种子细胞方面,目前的研究主要集中在干细胞、转染组织细胞系和原代组织细胞的体外培养上,但由于体外培养条件、伦理或潜在致瘤性等多种限制,目前仍无法满足组织工程角膜规模化构建对种子细胞的需求。近年来,本实验室成功建立了非转染无致瘤性的HCE、HCS和HCEP的三种组织细胞系,并以其为种子细胞先后进行了组织工程人角膜内皮、基质和上皮的体外构建研究,达到了较为理想的动物移植效果,使利用非转染人角膜组织细胞系规模化构建组织工程角膜成为可能。在载体支架方面,目前的研究主要集中在天然生物材料、人工合成高分子材料和生物大分子复合材料方面。鉴于天然生物材料或多或少地受到其病原体携带风险和来源的限制、人工合成高分子材料还存在有生物相容性不理想等缺陷,学者们便逐渐将研究重点转移到生物大分子复合材料的研发方面。在生物大分子复合材料的研究中,胶原蛋白由于具有来源广泛、在进化上高度保守、免疫原性低且生物相容性理想等诸多优势,已被广泛用于各种载体支架材料的制备研究,且利用人胶原蛋白复合支架成功构建出了组织工程角膜,但遗憾的是,所制备出的胶原蛋白复合支架仍然存在有力学性能欠佳、体内降解速度过快和制备成本较高等缺陷。近年来,高效无毒交联剂及其交联技术的快速发展以及非酶解/完整分子鱼类胶原蛋白制备技术的建立,为利用鱼类胶原蛋白制备组织工程角膜载体支架创造了条件。本文在前期研究工作的基础上,首次利用本实验室自主分离纯化的非酶解/完整分子鱼类胶原蛋白启动了鱼类胶原蛋白支架的制备研究,进而以其为载体支架、以非转染无致瘤性的三种组织细胞系作为种子细胞进行了组织工程全层人角膜(TE-flHC)的体外构建研究,旨在建立鱼类胶原蛋白支架的制备与TE-flHC体外构建的技术工艺,获得形态结构、属性和功能蛋白表达正常的TE-flHC。为了利用鱼类胶原蛋白制备出生物相容性理想的载体支架,本文采用本实验室业已纯化的孔鳐鱼皮胶原蛋白,选用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)交联剂和自制模具,进行了鱼类胶原蛋白支架的制备和鉴定。鱼类胶原蛋白的鉴定结果显示,所纯化的孔鳐鱼皮胶原蛋白纯度高,在SDS-PAGE电泳中无杂带,存在形式分别为单股α链、双股α链和三股α链,单α链的分子量约为120 kDa, Gly含量约占总氨基酸含量的32.34%,符合胶原蛋白的分子量和氨基酸组成的基本特征,为未被降解的胶原蛋白完整分子,可用于鱼类胶原蛋白复合支架的制备。在对所纯化胶原蛋白进行鉴定之后,本文以所得鱼胶原蛋白为原料,采用自制装置并通过EDC/NHS交联改性制备出了鱼类胶原蛋白支架。含水量测定结果显示,60mg/mL、80 mg/mL和100mg/mL胶原蛋白支架的含水量分别为90.53%±0.06%、89.88%±0.03%和86.34.%±0.11%；透明度与透光率结果显示,上述三种胶原蛋白支架均具有良好的透明度,其透光率分别为91.15±2.36%、89.77±2.30%和86.09±2.31%；力学性能检测结果发现,增加胶原蛋白支架的抗拉强度和断裂伸长率随胶原蛋白的浓度升高而提高。冰冻切片HE染色和扫描电镜结果表明,100 mg/mL胶原蛋白支架相对于60 mg/mL和80 mg/mL胶原蛋白支架,其组织结构较为致密,胶原纤维连续,孔径大小均匀,内部结构最佳。以上结果说明,所制备的鱼类胶原蛋白支架具有良好的光学性能、力学性能和组织结构,可望用作TE-flHC体外构建的载体支架。为了获得足量的人角膜种子细胞,本文首先对业已建立的三种非转染人角膜组织细胞系进行了扩增培养和鉴定。形态观察和生长曲线的鉴定结果显示,HCEP细胞、HCS细胞和HCE细胞仍分别保持有上皮样、成纤维样和多角形内皮样的形态特征,其群体倍增时间分别为38.5h、37.6 h和36.2 h；染色体鉴定结果显示,这三种细胞的特征染色体数目均为2n=46条；免疫细胞化学检测结果发现,HCEP细胞仍保持有其标志蛋白——角蛋白3/12以及功能蛋白——紧密连接蛋白(ZO-1),整联蛋白131、间隙连接蛋白-43、钠钾泵和乙醛脱氢酶的阳性表达；HCS细胞仍保持有其标志蛋白——波形蛋白以及功能蛋白——整联蛋白p1、间隙连接蛋白-43、钠钾泵和乙醛脱氢酶(ALDH)的阳性表达；HCS细胞仍保持有标志蛋白——血管内皮生长因子受体蛋白(FLK-1)以及功能蛋白——整联蛋白β5,紧密连接蛋白(ZO-1),间隙连接蛋白-43和钠钾泵的阳性表达。这些结果表明,体外扩增培养的三种人角膜组织细胞在形态、增殖能力、染色体特征以及功能蛋白表达方面仍然具有典型的原有属性和发挥形成细胞连接和穿膜运输的潜能,可作为种子细胞用于TE-flHC的体外构建。为了验证所制备的鱼类胶原蛋白支架的生物相容性,本文在获得足量的人角膜种子细胞后,利用MTT法、RT-PCR和免疫组织化学等方法检测了支架对三种人角膜组织细胞的细胞活力、细胞的生长与增殖调控基因表达以及功能蛋白表达的影响作用。MTT实验结果发现,鱼类胶原蛋白支架浸提液对体外培养的HCEP细胞、HCS细胞和HCE细胞的细胞活力没有显著影响(P>0.05)。RT-PCR结果表明,支架对三种种子细胞生长和增殖基因的表达水平也没有显著影响(P>0.05)。免疫组织化学检测结果显示,HCEP细胞在接种于支架表面后仍能保持其标志蛋白——角蛋白3/12、细胞连接形成蛋白——整联蛋白p1、ZO-1和间隙连接蛋白-43以及功能蛋白——钠钾泵和ALDH的阳性表达；HCS细胞在接种于支架表面后仍能保持其标志蛋白——波形蛋白、细胞连接形成蛋白——整联蛋白β1和间隙连接蛋白-43、以及功能蛋白——钠钾泵和ALDH的阳性表达；HCE细胞在接种于支架表面后仍能保持其标志蛋白——FLK-1、细胞连接形成蛋白——整联蛋白β5、ZO-1和间隙连接蛋白-43、以及功能蛋白——钠钾泵的阳性表达。这些结果表明,所制备的鱼类胶原蛋白支架对三种人角膜组织细胞不仅没有毒性,而且对其生长增殖调控基因、标志蛋白及功能蛋白的表达没有任何影响作用,与三种人角膜组织细胞具有理想的生物相容性,可以作为载体支架用于TE-flHC的体外构建。在获得足量正常的三种人角膜组织细胞和生物相容性理想的鱼类胶原蛋白支架后,本文以三种人角膜组织细胞为种子细胞、以鱼类胶原蛋白支架为载体支架,进行了TE-flHC的体外构建和鉴定研究。我们在优化种子细胞的接种天数后,分别将HCS细胞、HCE细胞和HCEP细胞接种于鱼类胶原蛋白支架,通过浸没培养或液气-液界面培养数天后成功构建TE-flHC,并通过外观观察、透明度检测、冰冻切片HE染色、荧光标记物检测、茜素红染色、透射电镜、扫描电镜和免疫组织化学检测对其透光性能、组织结构及种子细胞的蛋白表达等方面进行鉴定。透光性能检测结果表明,构建的TE-flHC具有良好的透光率与透明度,具有类似正常角膜的高透光性能。荧光标记物检测与HE染色结果表明,三种人角膜细胞分界明显,HCEP细胞在支架表面形成5至8层复层上皮结构；HCS细胞均匀分布于支架内部；HCE细胞形成完整的细胞单层结构。茜素红染色结果表明,细胞密度为2750±260个/mm2,相当于30岁成年人的角膜内皮细胞数。超微结构观察结果表明,HCEP细胞具有丰富的微绒毛结构,角膜上皮细胞与鱼类胶原蛋白支架的连接处存在致密的基底膜,并且细胞-细胞、细胞-支架之间结合紧密；HCS细胞呈纤维样,形态伸展,与鱼类胶原蛋白支架连接紧密；HCE细胞平整连续,形成了由完整的单层结构,与正常角膜内皮层相似。以上结果说明构建的TE-flHC具有类似于正常角膜的解剖结构。免疫组织化学检测结果显示,三种人角膜组织细胞均能维持其原有属性,并且形成了紧密连接、锚定连接和通讯连接,具有正常角膜相似的进行膜泡运输和抗UV氧化损伤的功能。综上所述,本文利用孔鳐皮胶原蛋白制备出了光学性能、力学性能和组织结构良好且与HCEP细胞、HCS细胞和HCE细胞具有理想生物相容性的鱼类胶原蛋白支架,进而以胶原蛋白支架为载体支架,以属性正常、增殖能力旺盛及功能蛋白表达正常的非转染HCEP细胞、HCS细胞和HCE细胞为种子细胞,成功体外构建出了与正常角膜结构、属性与功能相似的组织工程全层角膜。本文研究结果,对于鱼类胶原蛋白在组织工程领域的高质化应用具有重要意义,为我国数百万、全世界有数千万角膜病盲患者早日通过TE-flHC移植重见光明带来希望。