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本文以专一水解人参皂苷特定糖基为目的,进行了人参皂苷糖基水解酶的分离纯化、性质研究、以及人参皂苷Rg3和Rc的定向酶解反应,证明了酶法定向改造人参皂苷结构的可能性。 采用缓冲液抽提、硫铵沉淀、离子交换层析法从人参根中分离纯化了两种人参皂苷糖基水解酶——人参皂苷-β-葡萄糖苷酶和人参皂苷-α-阿拉伯糖苷酶。人参皂苷-β-葡萄糖苷酶被纯化了16倍,收率为14.4%,人参皂苷-α-阿拉伯糖苷酶被纯化了18.5倍,收率为4.6%。PAGE检测纯化后的酶为单一谱带。 人参皂苷-α-葡萄糖苷酶能水解人参皂苷Rg3生成人参皂苷Rh2,最适作用温度为55-60℃,最适pH为5.0,Ca++对该酶有激活作用,Cu++有抑制作用。该酶在60℃以下,pH4.0-7.0稳定,SDS-PAGE测得分子量为59kDa。此酶N-端氨基酸序列为SLDANYVPKYVTLPL,与已知序列的β-葡萄糖苷酶无同源性,人参皂苷-β-葡萄糖苷酶在水解特性上也不同于传统的β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)。本文还建立了人参皂苷-β-葡萄糖苷酶催化Rg3反应的米氏方程。 人参皂苷-α-阿拉伯糖苷酶能水解人参皂苷Rc生成人参皂苷Rd,最适作用温度为50℃,最适pH为5.0,Cu++对酶有抑制作用。该酶在60℃以下,pH4.0-6.0稳定,SDS-PAGE测得分子量为86kDa。 人参皂苷糖基水解酶在底物浓度10mg/ml,pH5.0,55℃的条件下水解人参皂苷Rg3,反应24h,Rg3的转化率可达到60%。经饱和正丁醇萃取,硅胶柱分离,酶解产物Rh2纯度可达90%,得率为32%。人参皂苷-β-葡萄糖苷酶能水解20(S)-Rg3和20(R)-Rg3分别生成20(S)-Rh2和20(R)-Rh2,水解速度大体相同。核磁共振(1HNMR、13CNMR)和质谱(MS)检测结果显示,酶解20(S)-Rg3所得产物为20(S)-Rh2,系统名称为3-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-达玛-24-烯-3β,12β,20(S)-三醇;酶解20(R)-Rg3所得产物为20(R)-Rh2,系统名称为3-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-达玛-24-烯-3β,12β,20(R)-三醇,分子式为C36H62O8,分子量为622。 人参皂苷糖基水解酶在底物浓度30mg/ml,pH5.0,50℃的条件下水解人参皂苷Rc,反应24h,Rc的转化率可达到60%。经饱和正丁醇萃取,硅胶柱分离,酶解产物Rd纯度可达90%,得率为34%。核磁共振(1HNMR、13CNMR)和质谱(MS)检测结果表明,酶解产物为20(S)-人参皂苷Rd,系统名称为3-O-(β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基)-20-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-达玛-24- 摘 要烯与p,126,20o卜三醇,分子式为 C48H82Ol以 分子量为 946。 本文在证明酶法定向转化人参皂着制备稀有皂苦可行性的同时,为深入研究糖着水解酶尤其是皂苦糖基水解酶奠定了一定的实验基础。