番茄红素是一种类胡萝卜素,其在减缓衰老、抵抗氧化等方面起着重要的作用。番木瓜果肉中番茄红素含量和比例决定了果肉的外观品质、营养价值,最终会影响其经济效益。因此,研究番木瓜番茄红素的代谢具有重要的理论和实践意义。番茄红素环化酶是类胡萝卜素合成通路的关键酶。在番木瓜中,番茄红素环化酶其中的两种同工异构酶分别为CpCYC-B和CpLCY-B。据研究表明,CpCYC-B和CpLCY-B都是组织特异性表达基因,其中CpCYC-B是有色体特异性表达基因,主要在果肉中表达,因此它能影响果肉中类胡萝卜素的含量和组分比例并造成果肉的颜色差异;而CpLCY-B主要在番木瓜的叶片和果皮中高表达。本研究以CpCYC-B和CpLCY-B为研究对象,克隆和鉴定启动子序列、分析关键顺式元件,并对不同区段启动子活性进行分析。通过对不同发育阶段的番木瓜果肉进行转录组分析,筛选与CpCYC-B和CpLCY-B启动子互作的转录因子,并通过酵母单杂交、酵母双杂交和双荧光素酶系统验证候选转录因子对番茄红素环化酶基因的转录调控功能。主要研究结果如下:1.CpCYC-B和CpLCY-B启动子的克隆和活性分析。从番木瓜中克隆了CpCYC-B、CpLCY-B的启动子序列,对其进行生物学信息分析和功能鉴定。Plantcare分析表明两基因启动子序列的顺式作用元件有差异。构建CpCYC-B和CpLCY-B全长启动子及一系列5’端缺失启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体,转化拟南芥及番茄检测启动子活性。结果表明,CpCYC-B和CpLCY-B启动子从翻译起始位点开始至其上游的500bp启动子分别具有最强和最弱活性。同时,对启动子缺失元件研究发现CpLCY-B启动子375bp区域存在1个沉默子元件,而CpCYC-B启动子235bp区域处的元件没发现特异性功能。2.CpCYC-B和CpLCY-B启动子与候选转录因子的互作筛选。对番木瓜“SunUp”和“Kapoho”不同发育阶段果实进行转录组测序,分析筛选出具有差异性表达的转录因子。选取其中可能参与番茄红素代谢的8个候选转录因子进行验证。以CpCYC-B、CpLCY-B的-0.5kb启动子及其关键顺式作用元件的序列为诱饵,利用酵母单杂交实验,最终筛选出能够结合启动子的两个转录调控因子CpbHLH1和CpbHLH2。3.候选转录因子CpbHLH1和CpbHLH2的功能鉴定。CpbHLH1和CpbHLH2均属于bHLH家族,与植物抗逆响应及光信号调控有关。构建含CpbHLH1、CpbHLH2的CDS序列和CpCYC-B、CpLCY-B启动子的双荧光素酶系统,侵染烟草瞬时表达,结果表明CpbHLH1和CpbHLH2可以分别抑制和促进CpCYC-B和CpLCY-B基因的表达。进一步实验表明CpbHLH1和CpbHLH2可能参与到了木瓜发育过程中的光信号调控,从而调控了类胡萝卜素通路的关键基因表达。