本研究从健康仔猪肠道内容物内分离筛选具有抗猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Coronavirus, TGEV)活性的益生菌,并进行种属的鉴定。然后在体外细胞感染模型上,采用MTT比色法,TCID5o法,间接免疫荧光法以及半定量RT-PCR法对初筛猪肠道益生菌株进行抗TGEV作用评价。旨在确定益生菌猪肠道分离株是否存在抗TGEV作用,评价其抗病毒水平,为今后开发抗腹泻病毒的微生态制剂奠定理论基础。在筛选菌株过程中,首先利用MRS培养基从健康仔猪肠道内容物内分离出54株益生菌。初步确定为乳酸菌并依次命名为R1-R54,作为试验菌株开展研究工作。在体外试管平台上,将TGEV与乳酸菌感作后取上清感染猪睾丸(ST)细胞,运用MTT比色法测定细胞活性初筛出12株对TGEV感染ST细胞具有较强抑制作用的菌株。进一步经过耐酸耐胆盐筛选淘汰4株。对剩余8株具有抗TGEV活性的乳酸菌菌株进行生化鉴定及16SrRNA鉴定。结果显示R3、R10、R15、R22、R38和R45为罗伊氏乳杆菌,R30为发酵乳杆菌,R51为肠膜明串珠菌。在评价初筛菌株的抗病毒作用时,利用MTT法测定益生菌处理后的细胞活性,经统计分析得出益生菌对细胞的最大无毒浓度；利用药敏试验筛选出对这8株益生菌均高度敏感的抗生素。然后,根据上述实验结果进行细胞平台上的益生菌抗病毒作用的研究和评价。以所选益生菌菌株及其代谢产物的最大无毒剂量为起点,将其梯度稀释成不同浓度,然后按三种不同方式(即先加益生菌/代谢产物后加病毒、病毒和益生菌/代谢产物同时加入、先加病毒后加益生菌/代谢产物)作用于ST细胞,通过MTT法检测细胞活性间接反映益生菌对TGEV的抑制作用。结果显示益生菌与细胞相互作用后再感染病毒,细胞活力升高,病毒感染能力下降；益生菌与病毒共同接入细胞,发现病毒对细胞侵害的能力降低,结果表明益生菌可能对病毒具有直接破坏作用；细胞感染病毒后再接入益生菌,结果发现益生菌在病毒感染细胞后抵抗TGEV感染的能力相对较弱。将TGEV分别与初筛益生菌在试管中作用,检测TGEV半数组织感染量(TCID50)。结果经8株益生菌处理后,在ST细胞模型上测得TGEV的TCID50/0.1mL分别为104·弼,10-5.03,10-4.59,10-5.33,10-5.47,10-5.82,10-5.44,10-6.21。与未作处理组病毒TCID50/0.1mL(10-6.46)比较,均有不同程度的降低,表明益生菌对病毒毒力具有显著的抑制作用。用初筛益生茵菌体及其代谢产物与细胞作用,再感染病毒,同时设正常细胞和病毒对照组。培养2小时后利用间接免疫荧光法检测病毒感染细胞量。结果显示益生菌及其代谢产物处理组荧光数量均有不同程度的减少,表明益生菌及其代谢产物在TGEV吸附细胞的过程中可能具有阻断作用。用初筛益生菌菌体及其代谢产物与TGEV在试管中作用90min,再用病毒处理细胞,同时设正常细胞和病毒对照组。培养24小时后应用半定量RT-PCR方法检测各组病毒的表达量。结果显示利用益生菌及其菌体处理过的病毒在细胞上的表达量明显减少,表明益生菌可能具有粘附病毒或者是直接破坏病毒的作用。综上所述,本试验从健康仔猪肠道成功分离并筛选出8株具有抗TGEV作用的益生菌,它们的菌体及代谢产物既可以降低病毒对细胞活力的影响,阻断TGEV对细胞的感染,还可能具有直接破坏TGEV,抑制其在细胞内增殖的作用。