骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是一种多能干细胞,可向肌细胞和脂肪细胞分化,从而影响动物体内肌肉和脂肪的组成。因此,研究BMSCs的增殖和成脂分化对于调控动物不同部位脂肪沉积、提高肉品质具有重要的意义。Ca²⁺是普遍存在于细胞内的重要信号物质,对细胞的增殖和脂肪生成具有重要的调控作用。然而,胞外钙离子([Ca²⁺]_o)对猪骨髓间充质干细胞（pBMSCs）增殖和成脂分化的影响及其作用机制还不清楚。首先,我们采用荧光定量PCR技术检测了[Ca²⁺]_o对pBMSCs成脂分化过程中不同时间细胞膜上钙离子通道,包括L型电压门控钙通道（L-VGCC）亚型α/δ1（CACNA2D1）、钙释放激活钙通道调控分子1（Orai1）、瞬时受体电位通道香草素受体亚型1（TRPV1）,以及钙敏感受体（CaSR）基因mRNA表达的影响。其次,我们采用CCK-8试剂盒、流式细胞分析、荧光定量PCR及Western blot等方法分别检测了[Ca²⁺]_o和/或nifedipine（L-VGCC阻断剂）、NPS2143（CaSR阻断剂）、U0126（ERK通路阻断剂）对pBMSCs增殖过程中的细胞数目、细胞周期分布、胞内钙离子([Ca²⁺]_i)浓度以及增殖相关基因、CaSR和ERK表达的影响,揭示了[Ca²⁺]_o对pBMSCs增殖的影响及作用机制。最后,我们研究了[Ca²⁺]_o对pBMSCs成脂分化和葡萄糖吸收的影响及其信号通路。采用油红O染色、TG浓度检测研究了[Ca²⁺]_o和/或nifedipine、NPS2143、BAPTA-AM([Ca²⁺]_i螯合剂)、KN-93（Ca MKII阻断剂）、Wortmannin（PI3K通路阻断剂）对pBMSCs成脂分化10天细胞聚酯的影响;通过Western blot进一步研究了[Ca²⁺]_o和各阻断剂对pBMSCs成脂相关基因（PPARγ、CEBPα、aP2）、CaMKII、PI3K/Akt及其下游FoxO1和AS160表达的影响。此外,我们还通过葡萄糖检测试剂盒、2-NBDG荧光葡萄糖吸收试剂盒、Western blot等方法研究了[Ca²⁺]_o对pBMSCs成脂过程中葡萄糖消耗及吸收、葡萄糖转运体4（GLUT4）表达与转位的影响及调控机制。研究结果如下:1、在pBMSCs成脂分化第5天,4 mM[Ca²⁺]_o极显著促进细胞膜上钙离子通道（CACN2D1、Orai1、TRPV1）以及CaSR基因的mRNA表达,提示[Ca²⁺]_o及相关的细胞膜上的钙离子通道、CaSR可能在pBMSCs成脂分化的调控中发挥重要作用。2、[Ca²⁺]_o剂量依赖性促进pBMSCs增殖,且[Ca²⁺]_o显著促进pBMSCs增殖过程中CaSR的mRNA和蛋白表达;[Ca²⁺]_o能够升高pBMSCs增殖过程中[Ca²⁺]_i浓度,促进pBMSCs增殖过程中S期的细胞分布比例和细胞增殖指数（PI）,同时抑制G0/G1期细胞分布比例;[Ca²⁺]_o能够促进pBMSCs促增殖相关基因（cyclinA2/D1/D3/E2、PCNA）的mRNA和/或蛋白表达,同时抑制p21基因的mRNA和蛋白表达;此外,[Ca²⁺]_o能够促进pBMSCs增殖过程中ERK1/2蛋白磷酸化;而阻断CaSR或抑制ERK1/2信号通路均能够逆转[Ca²⁺]_o促进pBMSCs增殖及ERK通路激活的效果。以上结果提示,[Ca²⁺]_o通过激活细胞膜上CaSR,提高胞内钙离子浓度,激活胞内ERK信号通路,进而促进pBMSCs的增殖。3、[Ca²⁺]_o显著升高pBMSCs成脂过程中[Ca²⁺]_i的浓度,促进胞内TG含量及成脂相关基因PPARγ、CEBPα、aP2的蛋白表达;抑制VGCC和CaSR可阻断[Ca²⁺]_o对[Ca²⁺]_i的升高作用;同时,[Ca²⁺]_o显著促进CaMKII、PI3K/Akt及其下游FoxO1的磷酸化;nifedipine、NPS2143、BAPTA-AM、KN-93、Wortmannin均能够逆转[Ca²⁺]_o对pBMSCs成脂分化以及CaMKII、PI3K/Akt和FoxO1磷酸化的促进作用。以上结果提示,[Ca²⁺]_o通过VGCC和CaSR促进[Ca²⁺]_i的升高,进而激活CaMKII-PI3K/Akt-Fox O1通路,从而促进pBMSCs的成脂分化。4、[Ca²⁺]_o显著促进细胞GLUT4的表达和转位、加强细胞的葡萄糖消耗和吸收,同时促进细胞CaMKII、PI3K/Akt和AS160的磷酸化;而nifedipine、BAPTA-AM、KN-93、Wortmannin均能逆转[Ca²⁺]_o对pBMSCs成脂过程中GLUT4表达及转位、葡萄糖吸收与消耗的促进作用。上述结果提示,[Ca²⁺]_o通过VGCC促进[Ca²⁺]_i的升高,进而激活CaMKII-PI3K/Akt-AS160通路,从而促进pBMSCs成脂过程中GLUT4的转位及葡萄糖的吸收。综上,[Ca²⁺]_o显著促进pBMSCs成脂过程中细胞膜钙离子通道及CaSR的表达;[Ca²⁺]_o通过激活pBMSCs细胞膜上的CaSR使[Ca²⁺]_i浓度升高,进而激活胞内ERK通路,促进细胞周期进程与细胞的增殖;在pBMSCs成脂分化中,[Ca²⁺]_o可通过VGCC或激活CaSR升高[Ca²⁺]_i浓度,进而激活CaMKII-PI3K/Akt-FoxO1/AS60信号通路,最终促进pBMSCs成脂分化和葡萄糖吸收。以上研究结果揭示了胞外钙离子对猪BMSCs增殖和成脂分化的影响及其作用机制,同时为营养调控动物脂肪沉积、提高肉品质提供重要的科学依据。