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布鲁菌病(简称布病)是由布鲁菌(Brucella)感染引起的一种动物源性人兽共患病,该病不但对畜牧养殖业危害巨大,对公共卫生安全也构成了威胁。家畜疫苗接种是布病防控的主要手段,特别是在发展中国家。然而,现有疫苗,包括国际上普遍使用的S19和我国自行研制的S2和M5,所提供的免疫保护效力并不理想。因此,改进和提高疫苗免疫原性和保护效力已成为研制新型布病疫苗的主要方向。美国学者在菌株RB51中过表达布鲁菌的保护性抗原SOD增强其疫苗功效。本研究以布鲁菌疫苗株S19为研究对象,借助广宿主穿梭载体将布鲁菌Omp31、BCSP31和UGPase基因转化至S19株中,实现自身免疫原性蛋白过表达,通过动物实验评价所构建的重组菌的免疫原性和免疫保护效果,探索重组菌该作为疫苗候选株的应用潜力,为防控家畜布病提供新策略。主要研究内容如下:首先,构建了含有双强启动子pR/pL-终止序列rrnbT1T2的重组广宿主穿梭质粒pBBR1MCS-PT,分别插入布鲁菌Omp31、BCSP31和UGPase基因,构建重组表达质粒pBBR1MCS-PT-Omp31、pBBR1MCS-PT-BCSP31和pBBR1MCS-PT-UGPase;将重组质粒电转至布鲁菌S19感受态细胞,经抗性筛选与PCR鉴定,获得重组菌株S19-Omp31、S19-BCSP31和S19-UGPase。SDS-PAGE与Western-blot检测结果均显示重组布鲁菌可表达Omp31、BCSP31和UGPase蛋白。重组菌株连续传代至第15代未出现基因丢失,具有良好的遗传稳定性;生长动力学曲线结果显示重组菌株与亲本株生长规律基本一致,表明基因过表达并未改变布鲁菌生长特性。接着,本研究对重组菌株的安全性和免疫原性进行了研究。动物安全性实验结果显示,以相同剂量免疫Balb/c小鼠时,S19-Omp31组、S19-BCSP31组与亲本株S19组小鼠体重、脾重和脾菌数均无显著差异(P>0.05);然而,S19-UGPase组在免疫高剂量条件下(1×10~8 CFU/mL和1×10~9 CFU/mL),其脾菌数显著高于S19组(P<0.05),这表明重组S19-Omp31和S19-BCSP31株具有良好的安全性。体液免疫检测结果表明,3组重组菌株均能有效产生针对S19株的特异性抗体,其中S19-BCSP31组和S19-UGPase组在第4周时抗体水平达到峰值,S19-Omp31组在第5周时达到峰值,其抗体效价均显著高于S19组(P<0.05)。同时,针对目的蛋白特异性抗体结果显示,S19-Omp31组和S19-BCSP31组的目的蛋白特异性抗体水平显著高于S19组(P<0.01)。细胞免疫检测显示,S19-Omp31组和S19-BCSP31组均能上调IFN-γ、INF-α、IL-2、IL-4和IL-12细胞因子的分泌,诱导机体产生Th1型(CD3~+CD4~+IFN-γ~+)细胞免疫应答;而S19-UGPase组IL-2和IL-12分泌显著高于S19组(P<0.05)、IFN-γ水平略低于S19组(P<0.05)、INF-α、IL-4和IL-10分泌水平与S19组无显著差异。最后,采用布鲁菌强毒株16M攻毒试验评价重组菌株的免疫保护效力。结果显示,S19-Omp31组和S19-BCSP31组的免疫保护单位分别为2.25和2.08,显著高于S19组(1.68);而S19-UGPase组的免疫保护单位为1.74,与S19组差异不显著。这表明重组菌株S19-Omp31和S19-BCSP31可提供良好的免疫保护效力。综上所述,本研究构建的3株重组布鲁菌株(S19-Omp31、S19-BCSP31和S19-UGPase)具有良好的遗传稳定性,其中S19-Omp31株和S19-BCSP31株具有良好的免疫原性,对强毒攻击能提供理想的免疫保护效力。本研究的结果将为新型布鲁菌疫苗的研制提供新策略。