漆酶(Laccase)是一种多酚氧化酶(p-diphcnol oxidase EC.1.10.3.2),属于蓝色氧化酶家族,是重要的木质纤维(lignocellulose)降解酶之一。漆酶能催化降解多种芳香族化合物特别是酚类,是一种天然环保型酵素。因而在纸浆生物漂白、染料脱色、废水处理、食品加工、生物质能源等领域具有广阔的应用前景,利用漆酶对木质纤维及一些高分子化合物的降解作用,进行合理的开发利用,可减少化学药品的使用量,降低生产成本和保护环境。　　 本实验在漆酶产生菌株粗毛栓菌(Trametes gallica)前期研究的基础上,通过对野生粗毛栓菌菌丝体进行亚硝基胍(NTG)诱变处理,采用PDA-RB亮蓝平板变色法初筛和ABTS法漆酶酶活力测定复筛,获得了1株漆酶高产诱变菌株T906。根据T906菌株的菌体特征并结合18S rRNA基因序列比对结果,确定T906属于粗毛栓菌(T.gallica)。　　 通过单因素实验优化了野生粗毛栓菌T.gallica及诱变菌株T906产漆酶的发酵条件,结果为:用高氮低碳无机盐培养液(MF9)培养时,培养温度30℃、摇瓶装液量50 mL(150 mL三角瓶)、起始pH 4.0、5.0％接种量、摇床转速150 r/min、培养时间7d、最佳氮源为干酪素、最佳碳源为甘油,诱变菌株漆酶活性达到104 U/mL,且产酶稳定,能够稳定遗传,野生菌株漆酶活性为38 U/mL。正交实验L9(43)优化培养基筛选实验的最佳组分为:干酪素1.5％,麦麸2.5％,甘油1.0％,磷酸氢二铵0.5％。通过培养基微量元素的进一步改进,菌株漆酶活性有了更大的提高,诱变菌达到213 U/mL,野生菌为55.5 U/mL,比前期所报道的该菌漆酶活性提高了200多倍(LM3培养基,静置培养24d-30 d最大酶活为1.00U/mL)。　　 两株菌漆酶酶学性质研究表明,在pH 2～5的范围内,漆酶是比较稳定的,最适pH为4.0,最适反应温度为60℃,经检测漆酶在30℃的半衰期为9天,诱导剂藜芦醇对粗毛栓菌的作用最显著。金属离子对漆酶活性有一定程度的影响,Cu2+离子浓度对漆酶活性有明显的促进作用,Co2+和Pb2+抑制漆酶的活性。Cu2+、Mg+、Zn2+、Ba2+对酶活力有一定的促进作用,其中以铜的促进作用对野生型菌漆酶影响最大,在含有Cu2+条件下所测酶活是对照的184％。Pb2+极大抑制诱变菌漆酶活性,在同一条件下检测不到漆酶活性,而野生菌在含有Pb2+条件下仍有59％的酶活性。　　 野生粗毛栓菌和诱变菌株T906发酵液离心后,对不同培养条件下漆酶同工酶进行Native-PAGE底物活性染色分析,观察不同表达阶段同工酶的表达状况,结果表明:诱变菌株T906在最佳产酶条件时,有三条漆酶同工酶条带均有较高的表达;两株菌酶液通过硫酸铵分级盐析、Macro-Prep DEAE弱阴离子交换层析、Bio-Gel P-60凝胶过滤层析等蛋白纯化步骤,获得一个漆酶同工酶,纯化产物通过SDS-PAGE电泳检测,达到了电泳纯。纯化倍数分别为13.36和11.08,酶活性回收率15.36％和15.42％。纯化酶经SDS-PAGE电泳检测为一条带。经SDS-PAGE电泳显示纯化漆酶同工酶的相对分子量均为61.5 kD。对粗毛栓菌和诱变菌株T906发酵菌体及发酵液进行了双向电泳检测,研究菌体及胞外蛋白的表达情况,结果表明两株菌的胞内外蛋白有明显的差异。通过双向电泳获得了三个漆酶同工酶蛋白,测定其等电点均为4.1,同时进行了酶蛋白氨基酸质谱分析。　　 通过对T.gallica和诱变菌株T906漆酶基因组DNA的RAPD扩增结果比较分析,发现粗毛栓菌野生菌株和诱变株既有相似性也有所不同,野生菌共扩增出了77条DNA片段,诱变菌共扩增出了81条DNA片段,对其中表现出差异性的一条随机引物克隆出了漆酶lac1基因上游约1000 bp的片段;同时适时跟踪了不同发酵时段粗毛栓菌野生菌株及诱变菌株T906漆酶相关基因的表达,结果证明野生菌株和诱变株T906在不同发酵时段漆酶相关基因表达有明显的不同,发酵7d时漆酶基因表达量达到最大。　　 根据质谱氨基酸序列及相关漆酶基因序列的保守性设计了引物,采用RT-PCR扩增方法获得了1条成熟肽编码区序列,通过连接pGEM-T载体并进行了测序,结果为:序列Blast与Trametes trogii lcc1 gene同源性90％,测序得出克隆片段长度2007bp,推导编码669氨基酸,是一个成熟蛋白编码序列,确定为栓菌属的lcc1基因。　　 从已经构建的pGEMT-lcc1克隆载体上酶切并纯化出带有酶切位点的lcc1编码序列,与酶切后具有相同粘性末端的pPIC9K表达载体相连接,构建出pPIC9K-lcc1融合表达载体。转化毕赤酵母GS115并诱导表达,重组菌漆酶活性达1.00 U/mL。