论文部分内容阅读
缺血再灌注损伤是缺血缺氧器官在恢复血供和氧供后损伤反而加重的病理生理过程,临床上肝移植、严重肝外伤及肝叶切除等过程中,都不可避免的造成肝脏短暂或较长时间的缺血缺氧损伤,引起肝脏的缺血再灌注损伤(HIRI)。肝脏缺血再灌注损伤可以激活免疫应答,引起局部及全身炎症反应,加重组织、器官的损伤,严重者可导致死亡。但对于肝脏缺血再灌注损伤,临床尚无有效预防和治疗方法。因此,如何减轻移植肝脏的缺血再灌注损伤是肝脏外科领域中的热点和难点问题之一。近年来,许多动物实验研究发现,白细胞在内皮细胞上的滚动,参与缺血再灌注的损伤,可能与选择素的介导有关。P选择素是相对分子质量约为140kU的跨膜糖蛋白,它是凝血酶活化的血小板和血管内皮细胞上的白细胞粘附受体,通常储存在内皮细胞的W-P小体和血小板中。在受到炎症、缺血、缺氧刺激时,P选择素可迅速在内皮细胞的质膜上表达,与内皮细胞上TNF-a的未知配体结合,参与炎症反应。E选择素是相对分子质量为110kD的跨膜糖蛋白,属人类白细胞分化抗原CD62E,又被称为内皮细胞白细胞黏附分子1,主要在内皮细胞上表达.在没有任何刺激时,E选择素基本不表达,但当受到。TNF-a、IL-1、IL-6等刺激时,E选择素在内皮细胞上的表达增加。相关文献报道,P-选择素和E选择素在脑、肾、胰腺、肠道等重要组织器官的缺血再灌注中发挥着重要作用。目前,虽然也有少研究表明,P选择素或者E选择素在肝脏缺血再灌注损伤中的起重要作用,但都尚未证实。而对于P选择素和E选择素在肝脏缺血再灌注损伤中的作用研究相对更少。因此,了解P选择素和E选择素在肝脏缺血再灌注损伤中的作用,减轻肝脏缺血再灌注损伤,有十分重要的临床意义。[目的]通过建立大鼠肝脏70%缺血再灌注损伤模型,应用P选择素和E选择素抗体对实验动物进行预处理,观察减少P选择素和E选择素的表达对肝脏缺血再灌注损伤的影响,为临床肝移植缺血再灌注损伤的防治提供一种新的思路。[方法]1、参照Nauta RJ等的方法操作,建立大鼠70%肝脏缺血再灌注损伤模型。2.、SPF级健康成年雄性SD大鼠,体重220-250g,随机分为五组：假手术组(Ⅰ组)：术前不给予注射试剂,仅开腹后游离肝十二指肠韧带,并于60min后关腹；(2)缺血再灌注组(Ⅱ组)：术前不给予注射试剂,行肝脏缺血再灌注处理；(3)注射P选择素抗体+缺血再灌注组处理组(Ⅲ组)：开腹后,建立热缺血模型,在灌注前5min,按照2mg/kg经下腔静脉给药；(4)注射E选择素抗体+缺血再灌注组处理组(Ⅳ组)：开腹后按照12.5ug/kg进下腔静脉给药,余同3组；(5)注射P/E选择素抗体+缺血再灌注组处理组(V组)：开腹后经下腔静脉不同部位给予分别注射P/E选择素抗体,余同3组；术后分别于1h、6h、24h经腹主动脉采血5m1并获取新鲜肝脏组织,检测血清ALT和AST评价肝功能。ELISA法检测MDA和SOD,观察肝细胞受损伤程度和对肝脏缺血再灌注的抵抗能力。免疫组化法观察P选择素、E选择素的表达。病理切片观察肝脏形态学改变度,评价肝组织损伤情况。[结果]1、参照Nauta RJ等的方法成功制备了大鼠肝脏70%缺血再灌注损伤模型90例,18例假手术组,72例肝脏缺血再灌注组,肝脏热缺血时间为60min。2、P选择素和E选择素的表达对肝脏的影响：①P选择素和E选择素的表达。免疫组化结果显示,Ⅱ组(I/R组)与Ⅰ组(假手术组)相比,P选择素和E选择素的表达升高(P<0.05)；Ⅲ组(P选择素单克隆抗体治疗组)与Ⅰ组、Ⅱ组相比,Ⅲ组P/E选择素的表达降低(P<0.05),阳性率下降；Ⅳ组(E选择素抗体治疗组),P/E选择素的表达降低(P<0.05),阳性率下降(P<0.05)；V组(P/E选择素抗体治疗组)与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组相比,P选择素和E选择素的阳性率下降最明显(P<0.05)。②肝功能的影响。Ⅱ组(I/R组)与Ⅰ组(假手术组)相比,Ⅱ组转氨酶(ALT、AST)明显升高(P<0.05)；Ⅲ组与Ⅳ组与Ⅱ相比,Ⅲ组、Ⅳ组转氨酶(ALT、AST)降低(P<0.05),V组(P/E选择素抗体治疗组)与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组相比,转氨酶(ALT、AST)明显降低(P<0.05)。③肝形态学的改变。Ⅰ组(假手术组),可见肝脏大小、色泽正常,显微镜下,无变性或坏死,肝脏组织结构清楚,肝索结构清晰,排列整齐,肝血窦不扩张,仅见少许炎症细胞浸润；Ⅱ组(缺血再灌注组),肝细胞水肿,肝脏基本组织结构不清晰,肝索、肝血窦结构发生变化,肝细胞呈气球样变,汇管区大量炎症细胞浸润,光镜下可见多发坏死灶。Ⅲ组(P选择素抗体组),对比Ⅱ组,整体肝脏组织结构改善,任可见肝脏体积变大,肝细胞肿胀,肝细胞呈气球样变和气球样变两者混合,汇管区大量炎症细胞浸润,光镜下可见点状坏死和局灶性坏死；Ⅳ组(E选择素抗体组),对比Ⅱ组,整体肝脏组织结构改善,肝脏体积比正常肝脏稍大,肝细胞肿胀不明显,肝细胞空泡状变性减少,肝血窦轻度扩张汇管区少量炎症细胞浸润,可见点状坏死和局灶性坏死；V组(P/E选择素抗体组),同Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ相比较,组肝细胞损伤较轻,肝索排列整齐,肝血窦扩张不明显,肝细胞及汇管区基本正常,肝小叶结构基本正常,仅少数肝细胞轻度水肿,炎症细胞浸润减少。3、肝脏组织MDA和SOD的变化：采用ELISA试验方法,测大鼠样品中MDA和SOD的含量。与Ⅰ组相比,Ⅱ组、Ⅲ组及Ⅳ组及Ⅴ组肝脏组织匀浆MDA水平均升高(P<0.05),差异有统计学意义。与Ⅱ组相比,Ⅲ组肝脏组织匀浆MDA水平减低(P<0.05),Ⅳ组肝脏组织匀浆MDA水平减低(P<0.05),V组肝脏组织匀浆MDA水平低于Ⅲ、Ⅳ组,明显低于Ⅱ组(P<0.05)；SOD在缺血再灌注1h时开始下降,24h时可见明显改变。与Ⅰ组相比,Ⅱ组、Ⅲ组及Ⅳ组及Ⅴ组肝脏组织匀浆SOD水平均升高(P<0.05),差异有统计学意义。与Ⅱ组相比,Ⅲ组肝脏组织匀浆SOD水平升高(P<0.05),Ⅳ组肝脏组织匀浆SOD水平升高(P<0.05),V组肝脏组织匀浆血清SOD水平明显高于Ⅲ、Ⅳ组(P<0.05),也显著高于未遭受任何肝脏缺血性损伤的Ⅰ组；3、肝脏组织细胞凋亡的变化情况：凋亡细胞具有以下特征：单细胞、无炎症、细胞膜的卷曲、棕色颗粒或破碎的细胞核。TUNEL法检测发现,Ⅰ组(假手术组)肝组织很少出现凋亡小体。Ⅱ组(I/R组)1h再灌注1h,仅见少量凋亡细胞；再灌注6h肝组织中凋亡小体增多；再灌注24h可见细胞凋亡小体大量聚集,并出现坏死现象。Ⅲ组肝组织中各时间段,凋亡小体数都少于非治疗Ⅱ组；Ⅳ组肝组织中各时间段,凋亡小体数都少于非治疗Ⅱ组；Ⅴ组凋亡小体数少于Ⅲ、Ⅳ组,明显少于Ⅱ组。[结论]1、参照Nauta RJ等的方法成功制备了大鼠肝脏70%缺血再灌注损伤模型,其操作简单、手术安全,适合缺血再灌注损伤的研究。2、大鼠肝脏缺血再灌注损伤中,P-选择素和E-选择素表达都升高,两者同时共同参与了肝脏缺血再灌注损伤,介导白细胞的活化及组织内皮细胞的损伤；不同在于P选择素介导炎症的初始阶段,随后慢慢减弱,在6h后,E选择素的作用大于P选择素,在炎症的后期阶段起重要作用程。3、P选择素单抗和E选择素抗体可以中和肝脏缺血再灌注后P选择素和E选择素的表达,对肝缺血再灌注损伤具有保护作用,同时使用两种抗体治疗效果优于一种抗体,具体机制有待进一步研究。