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血管抑素（Angiostatin，AS）是血浆纤溶酶原（Plasminogen，PLG）经蛋白水解酶降解生成的多肽片段，是直接作用于血管内皮细胞的血管生成抑制剂。AS可以阻抑血管生成治疗由病理性血管形成而导致的疾病，尤其是可通过抗肿瘤新生血管生成抑制肿瘤的生长与转移，有重要的临床应用价值。本研究以高效、低毒、广谱且无耐药性产生的内源性血管抑制因子AS为研究对象，构建含AS基因的分泌型重组表达质粒pEZZ18-AS，在E.coli DH5α内表达并对其进行鉴定。 本研究第一部分包括肝组织中总RNA的分离提取；RT-PCR扩增出血管抑素基因。首先，采集术后新鲜肝组织，并于无RNase的条件下分离纯化总RNA。其次，在其完整性及纯度鉴定后做RT-PCR扩增目的基因AS，分别在上下游引物引入限制性内切酶EcoR I与Xba I的酶切位点及相对应的保护碱基。本部分成功获取AS（即Kringle 1-4区域）与PLG Kringle 1-5区（即K1-5）的基因片段。将K1-5 PCR产物测序，结果为：除测序引物后边有一段不稳定序列，其余序列均与Gene Bank里PLG cDNA中相应核酸序列完全相同，无碱基错配、插入或遗漏的出现。 第二部分是AS基因分泌型表达载体的构建。用限制性内切酶EcoR I与Xba I对目的基因AS、表达载体pEZZ18行双酶切，酶切产物纯化后利用大肠杆菌T4DNA连接酶连接构成重组子pEZZ18-AS，并转化E.coli DH5α，经氨苄青霉素LB平板初筛后，以菌液PCR和重组子的单、双酶切行进一步鉴定。随后取通过上述鉴定的重组克隆菌，对重组子插入片段测序，结果为：AS基因开放读码框与表达载体的读码框正确匹配相连，但在其Kringle 4区相当于编码PLG的Lys414密码子AAA的第一位碱基由A突变为G，导致相应的氨基酸残基突变为Glu。 天津医科大学硕士学位论文 本研究第三部分为重组表达质粒在 E colt DH5a中的初步表达与鉴定。将 含重组质粒pEZZ18叭S与空质粒pEZZ18的 Ecoli DH5a同时于 AInp”LB液体 中培养，当振摇培养的菌液OD。值约为0．5时，于诱导对照管中加入IPTG至 终浓度为Inunoffe：继续培养二小时，将离心收集的诱导及未诱导的细菌沉淀 进行SDS－PAGE。与空质粒菌比较，重组菌在略小于66kD的标准蛋白处出现 一条特异条带，与融合蛋白ZZ－AS分子量理论值6IkD相符。而在重组菌与含 空质粒菌经超声碎细胞并离心后，取上清进行ELISA检测，两组所测OD0。值 比较，P＜0刀 1，差异有统计学意义，说明重组菌里有重组 AS表达。 本研究成功构建了含AS基因的分泌型表达质粒pEZZ18－AS，并在ECOli DH5a中进行了表达，经SDS－PAGE及ELISA法鉴定重组培养菌内有AS的表 达。为以后获得足量AS进行抗肿瘤血管生成的体内外研究奠定了基础。