隐性核不育由于具有不育性彻底且稳定、恢复源广和细胞质来源丰富等优点,在油菜杂种优势利用中具有很大的潜力。然而,由于不能获得高效而经济的核不育系保持方法,大部分的隐性核不育不能广泛应用于油菜杂交种生产。幸运的是,隐性上位互作核不育系9012AB的发现克服了传统隐性核不育在杂种优势应用上的困难。遗传分析表明,9012AB的育性受两对重叠隐性不育基因(ms3和ms4)和一对隐性上位抑制基因(esp)互作控制,两对隐性不育基因纯合时导致雄性不育,但任何一个不育基因为显性或隐性上位抑制基因纯合时育性恢复。根据这一遗传模型,将纯合不育系和临保系杂交就可以获得100%不育群体,避免了传统隐性核不育系在杂交种生产过程中拔去母本行50%可育株的麻烦。在中国,这种隐性核不育系的保持途径已经成功应用于甘蓝型油菜杂交种的生产。值得注意的是,通过传统的育种方法选育不育系及其临保系是一项繁琐、低效的工作,因此,为了加快育种进程,必须开发与ms3、ms4和esp紧密连锁的分子标记。本研究以甘蓝型油菜隐性上位互作核不育系9012AB、GosAB及其临保系T45为研究材料,构建了两个BC1定位群体,并开发与esp基因紧密连锁的分子标记,进而实现esp基因的精细定位,取得的主要结果如下：1.esp基因连锁分子标记的开发。本研究采用以下3种策略开发与esp基因紧密连锁的分子标记。第一、BSA法结合AFLP技术。通过筛选2,816对AFLP引物组合,获得了17个与esp基因连锁的AFLP标记,其中10个AFLP标记在包含143个单株的群体Ⅰ中跟esp基因是共分离的。为了方便大群体分析,将其中7个共分离的AFLP标记转化成显性的SCAR标记。第二、遗传图谱整合。根据esp基因在甘蓝型油菜N7连锁群上的相对位置,从芸薹属A7连锁群相对应的区间挑选PCR标记对含有188个单株的群体Ⅱ进行分析,结果表明,总共有11个PCR标记,包括1个SCAR标记、7个SSR标记和3个IP标记,跟esp基因是连锁的。另外,3个基于白菜BAC序列的SSR标记在群体Ⅱ也是跟esp基因连锁的。第三、比较作图。通过对上述两个定位群体中部分标记序列的BLASTN分析并结合前人的研究结果,发现甘蓝型油菜N7连锁群esp基因及其邻近区间由G、H、F和B等4个保守区段组成,其中F保守区段将esp基因包含在内。随后,F保守区段中的拟南芥基因被用于IP标记的开发。IP引物设计在与拟南芥基因外显子高度同源的芸薹属EST和GSS序列上,总共设计122对引物。亲本多态性检测和群体分析表明,一共有14个IP标记在两个BC1定位群体中都是与esp基因紧密连锁的。2.esp基因的精细定位。将与esp基因紧密连锁的PCR标记进一步分析3,878个单株的群体Ⅰ和3,484个单株的群体Ⅱ。为了提高大群体的分析效率,采用侧翼分子标记分析策略。在群体Ⅰ中,esp基因被定位在SCAR标记WSC6和IP标记IP5-3之间,其遗传距离分别为0.206cM和0.129cM。在群体Ⅱ中,esp基因被定位在IP标记IP36和IP2-3之间,其遗传距离分别为0.057cM和0.057cM。整合两个群体的定位结果,esp基因被IP标记IP36和IP5-3所限定在一个很小的遗传区间。虽然一共分析包含7,362个单株的两个BC1定位群体,仍然有6个SCAR标记和3个IP标记在两个群体中都是与esp基因共分离。3.甘蓝型油菜和拟南芥在esp区间的微观共线性分析。利用来源于拟南芥的IP标记精细定位esp基因为分析甘蓝型油菜和拟南芥之间的微观共线性提供了便利。甘蓝型油菜和拟南芥在esp区间的完美共线性被染色体片段的倒位和基因的插入所打断。由于倒位的发生,导致了由esp两侧最近的标记IP36和IP5-3所限定的拟南芥候选区间从一个变成为两个。第一个拟南芥候选区间是由标记IP5-3和IP9-4界定,区间大小为54kb,包含12个预测基因。第二个拟南芥候选区间是由标记At3G24315和IP36界定,区间大小为40kb,包含8个预测基因。遗憾的是,在这20个拟南芥预测基因中,没有鉴定出esp的候选基因。