目的：广州管圆线虫病是一种食源性寄生虫病，人因生食含有广州管圆线虫第三期幼虫的淡水螺而感染。自2006年在北京广州管圆线虫病疫情暴发以来，广州管圆线虫的研究再次引起广泛重视。但有关广州管圆线虫的基础研究如关键致病基因的鉴定及其致病机制的报道较少。广州管圆线虫感染主要引起以嗜酸性粒细胞浸润为主的中枢神经系统炎症，因此，嗜酸性粒细胞的浸润及其免疫病理的调节是研究重点，而虫源性分子的筛选与鉴定是研究的热点之一。半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin)是一类广泛存在于病毒、细菌、动植物、哺乳动物体内的蛋白酶抑制剂，参与多种生理与病理过程，如蛋白质的分解代谢、感染与免疫、肿瘤的侵袭与转移等。Cystatin不仅具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，而且还具有免疫调节活性。有关研究发现，寄生虫分泌的cystatin样分子能下调宿主的免疫反应，可能还与寄生虫与宿主的共进化有关。但目前还未见广州管圆线虫cystatin样分子的研究报道。本课题组在开展广州管圆线虫基因组研究时，通过对EST序列的分析，发现了一个具有cystatin特征的序列。在此基础上，我们开展了广州管圆线虫cystatin(AcCystatin)的功能研究，为阐明AcCystatin在寄生虫感染或寄生虫与宿主的相互作用中的精确机制提供依据。　　 方法：①利用在线生物信息学方法，对AcCystatin的基因编码序列及氨基酸序列进行分析。应用RT-PCR技术从广州管圆线虫第四期幼虫cDNA中扩增AcCystatin的全编码序列，并将其克隆入载体pGEX-4T-1中，构建原核表达AcCystatin的重组质粒，并进行重组表达AcCystatin(rAcCystatin)。②采用多种鉴定方法对rAcCystatin进行鉴定，包括半胱氨酸蛋白酶抑制活性、免疫学活性以及蛋白质谱鉴定等。③用RT-PCR方法检测AcCystatin在虫体不同时期的表达。用免疫荧光定位方法检测AcCystatin在虫体的分布特点。④免疫BALB/C小鼠，获得抗rAcCystatin的免疫血清；采用ELISA法测定免疫小鼠血清中特异性抗体滴度及其抗体亚型，用Western Blot技术对rAcCystatin进行抗原性和免疫原性鉴定。⑤分离培养大小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)，利用流式细胞技术检测rAcCystatin对BMDC表型的影响。⑥利用大小鼠腹腔巨噬细胞进行rAcCystatin诱导一氧化氮(NO)产生的体外实验，并根据生物信息学预测结果，对AcCystatin序列中可能的与刺激NO产生相关的结构域进行基因定点突变，构建表达突变体蛋白的原核表达重组质粒，并进行重组表达。⑦采用细胞学技术评价AcCystatin的突变蛋白对巨噬细胞产生NO的影响。　　 结果：　　 ⑴AcCystatin具有cystatin超家族成员的典型序列特征，为Ⅱ类cystatin。　　 ⑵AcCystatin典型的序列特征含有保守结构域——半胱氨酸蛋白酶活性抑制结合区域(cystatin G--QVVAG--PW)，理论上预测AcCystatin具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。AcCystatin序列中可能存在与NO活性有关的基序。　　 ⑶在同源进化上，AcCystatin与线虫cystatin较为接近，而与人、大鼠和小鼠的cystatin遗传距离较远。　　 ⑷在生物信息学分析的基础上，从广州管圆线虫第四期幼虫cDNA中克隆到AcCystatin全编码基因序列；RT-PCR结果显示AcCystatin在第三期、第四期幼虫及成虫均有表达。　　 ⑸构建了rAcCystatin高效表达体系，并获得了具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的可溶性rAcCystatin。　　 ⑹Western Blot结果显示：感染广州管圆线虫大鼠的血清不能识别rAcCystatin，而感染小鼠的血清能识别rAcCystatin。　　 ⑺rAcCystatin免疫小鼠可产生特异性抗体，并能识别AC粗抗原(包括ES、幼虫及成虫抗原的相应蛋白条带)，其抗体亚型以IgG1增高为主，其次为IgG2b和IgG2a。　　 ⑻流式细胞检测结果显示：受rAcCystatin刺激后，大鼠BMDC的表型分子无明显变化(OX62除外)，小鼠BMDC的表型分子表达明显增加(包括MHCII)。　　 ⑼体外实验显示：大鼠腹腔巨噬细胞受INF-γ+rAcCystatin的刺激后，NO无明显变化；而小鼠腹腔巨噬细胞受INF-γ+rAcCystatin刺激后，NO产量明显上调。　　 ⑽成功构建了基于NO相关活性位点N32(序列中第32位氨基酸残基，天冬酰胺Asparagine，N或Asn)点突变的AcCystatin突变体，并获得了仍保持免疫学活性的突变型rAcCystatin。　　 ⑾体外实验显示：N32点突变的rAcCystatin对INF-γ活化的小鼠原代腹腔巨噬细胞NO释放的上调作用消失或者显著减弱。实验证实N32是AcCystatin保持NO释放活性的特异性位点。　　 结论：　　 ⑴本研究证实所获得的广州管圆线虫cystatin属于cystatin超家族Ⅱ类cystatin(rAcCystatin)，在第3期、第4期幼虫及成虫阶段均有表达，且组织特异性不明显。　　 ⑵采用pGEX-4T-1/BL21原核表达系统，成功获得了具有生物学活性的可溶性rAcCystatin。rAcCystatin具有较强的半胱氨酸蛋白酶抑制活性，且能诱导小鼠产生特异性的多克隆抗体。这些结果为深入开展AcCystatin的功能研究提供了实验条件。　　 ⑶研究发现：①感染AC的大鼠血清不能识别rAcCystatin，而感染的小鼠血清能识别rAcCystatin；②受rAcCystatin刺激后，大鼠BMDC的表型分子无明显变化，小鼠BMDC的表型分子表达明显增加；③rAcCystatin能促进小鼠腹腔巨噬细胞在INF-γ作用下的NO产生，而对大鼠的作用不明显。结果提示，大小鼠对AcCystatin的免疫应答存在明显差异，这种差异可能与大小鼠对AC寄生的适应性差异有关。　　 ⑷在AcCystatin序列中存在与INF-γ活化的巨噬细胞NO产生相关的功能域或基元，N32点与维持该功能域的功能相关。