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抗生素的抗肿瘤作用与肠道菌群相关,而人参多糖可以调节肠道菌群,我们认为人参多糖联合抗生素可能通过调节肠道菌群协同发挥抗肿瘤作用。本课题通过研究人参多糖联合抗生素治疗荷瘤小鼠对其抑瘤率、肠道菌群、中短链脂肪酸、内源性代谢物及相关蛋白表达、细胞因子水平的影响,初步阐明人参多糖联合抗生素的抗肿瘤作用及肠道菌介导机制。研究共分五个部分:一、人参多糖的制备及质量表征采用水提醇沉的方法制备人参粗多糖,得率为17.4%;通过苯酚硫酸法测定人参粗多糖中的总多糖含量为57.21%,以考马斯亮蓝法测定蛋白质含量为2.97%,以间羟基联苯法测定糖醛酸含量为11.71%;同时,采用HPGPC-ELSD方法表征了人参多糖的分子量范围在1.00-33503.68 kDa之间,利用PMP柱前衍生化HPLC-UV方法测定人参多糖由甘露糖(Mannose,Man)、葡萄糖醛酸(D-Glucuronic acid,GlcA)、半乳糖醛酸(D-Galacturonic acid,GalA)、鼠李糖(L-rhamnosemonohydrate,Rha)、葡萄糖(Glucose,Glc)、D-半乳糖(D-Galactose,Gal)和阿拉伯糖(L-Arabinose,Ara)按 1.00:7.04:24.06:18.11:728.50:10.50:9.80的摩尔比组成。二、人参多糖联合抗生素的抗肿瘤作用研究以C57BL/6小鼠为研究对象,通过腹部皮下注射MC38肿瘤细胞建立结肠癌MC38荷瘤小鼠模型,并将其分为空白对照组(Control)、抗生素组(ABX)、人参多糖联合抗生素低(ABX+Low)、中(ABX+Middle)、高(ABX+High)剂量组,通过比较各组小鼠瘤重变化及肿瘤组织细胞凋亡情况(TUNEL法),评价人参多糖联合抗生素的抗肿瘤效果。结果表明,与抗生素组比较,人参多糖联合抗生素治疗可以更有效地抑制小鼠结肠癌MC38移植瘤的生长,抗生素组和人参多糖联合抗生素低、中、高剂量组的抑瘤率分别为40%、77%、92%、58%,且人参多糖联合抗生素相比于抗生素能更有效地诱导小鼠结肠癌MC38肿瘤组织细胞发生凋亡,其中,人参多糖联合抗生素中剂量组细胞凋亡率最高。三、人参多糖联合抗生素治疗对荷瘤小鼠肠道菌群的影响采用16S rRNART-PCR测序技术研究人参多糖联合抗生素对小鼠肠道菌群的影响,结果显示,经抗生素处理后小鼠肠道菌群的丰富度明显降低且结构发生显著改变,而人参多糖可提高某些菌群丰度,如Bacteroidales_S24-7_group、Prevot0ellacea_UCG-001等,同时增加菌群多样性;通过差异物种分析共筛选出了 18个经抗生素和人参多糖联合抗生素治疗后物种丰度发生明显变化的菌群,其中,人参多糖联合抗生素中剂量组Providencia的相对丰度显著降低,Escherichia-Shigella、Parasutterella、Bacteroidales_S24-7_group、Prevotellaceae_UCG-001、norank_f_Lachnospiraceae、Lactobacillus、Enterococcus 的相对丰度有所增加,结合差异物种含量变化,将这些差异物种初步分为两类,并与抗肿瘤作用进行关联分析,表明人参多糖与增加抗生素发挥抗肿瘤作用菌群丰度(如unclassified_f_Enterobacteriaceae、Enterococcus)和调低由抗生素引起的对发挥抗肿瘤作用产生不利影响的菌群丰度(如Providencia)相关联,即可能以两种方式发挥协同抗肿瘤作用。四、人参多糖联合抗生素治疗对荷瘤小鼠中短链脂肪酸及内源性谢物的影响采用柱前衍生化UHPLC-QTOF-MS/MS技术和基于UHPLC-QTOF-MS/MS技术的非靶向代谢组学方法,分别对小鼠粪便中中短链脂肪酸和小鼠血液、尿液及粪便中其它内源性代谢物进行分析。结果显示,与抗生素组比较,人参多糖联合抗生素显著增加了小鼠粪便中丙酮酸、丁二酸和乳酸水平,并且明显改变了小鼠血清、尿液及粪便的代谢轮廓,筛选并鉴定了抗肿瘤作用 相关的生物标志物,包括血清中PC(16:1(9Z)/22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、PE(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/P-18:1(9Z))等 28个,尿液中 5,6-Dihydroxyindole、L-Dopa 等 25 个,粪便中 7-Aminomethyl-7-carbaguanine、4a-Methylzymosterol等15个,涉及的相关代谢通路包括脂质代谢、初级胆汁酸代谢、色氨酸代谢和酪氨酸代谢等。五、人参多糖联合抗生素治疗对荷瘤小鼠相关蛋白表达及免疫炎症因子水平的影响采用ELISA、RT-PCR和免疫组化法等方法,分别对小鼠外周血中的细胞因子水平、肿瘤组织中的TLRs mRNA的相对表达量以及肿瘤、脾、结肠组织中NF-κβ和TNF-α的表达进行检测。结果显示,与抗生素组比较,人参多糖联合抗生素显著增加了免疫调节因子IFN-y、IL-17、IL-10水平,改变了 TLRs在肿瘤组织中的表达,其中TLR2、TLR4、TLR9的相对表达量增加而TLR3、TLR5、TLR7的相对表达量降低,同时,NF-κβ在脾、结肠组织中的表达增加,而在肿瘤组织中降低。因此,推测肠道菌、肠道代谢物通过激活免疫反应以及肿瘤组织中TLRs/NF-κβ信号通路,最终引发NF-Kβ介导的细胞凋亡机制诱导了人参多糖联合抗生素的抗肿瘤作用。