DHX15是近几年发现的胞浆RNA识别受体,属于DEXD/H-解旋酶家族,能够通过C端的解旋酶结构域与polyI:C或病毒的dsRNA结合,然后通过N端的DEXDc结构域与VISA相互作用,激活IRF3、NF-κB和MAPK,诱导IFN-β、IL-6和TNF-a的分泌。迄今为止,仅人和小鼠的DHX15被鉴定,猪DHX15(porcineDHX15,pDHX15)的研究尚未报道。因此,本研究首先克隆pDHX15基因,然后对其遗传进化关系和分子结构特征进行分析,继而对其在诱导I型干扰素中的作用进行了初步研究。本研究主要内容如下:1.pDHX15基因的克隆与序列分析应用RT-PCR技术从猪外周血淋巴细胞(PBMCs)中克隆了pDHX15基因,然后将其插入pJET1.2/blunt克隆载体中,构建了pJET1.2-pDHX15。序列分析发现,pDHX15基因开放阅读框架(ORF)全长2388bp,编码795个氨基酸,与人类、小鼠、大鼠、牛、羊、犬、猫、马等哺乳动物的同源性都在99.4%以上,而与两栖类非洲爪蟾、中华鳖、鸟类绿头鸭、鱼类斑马鱼的同源性相对较低,分别为92.2%、95.3%、94.2%和91.3%;结构分析显示,pDHX15含有N端的两个松散结构域、DEAH-box保守结构域、HELICc解旋酶活性结构域、HA2结构域以及DUF结构域。2.pDHX15的组织差异表达与亚细胞定位分析应用半定量RT-PCR和Real-timePCR技术分析pDHX15的mRNA在不同组织的表达情况。结果显示,pDHX15mRNA广泛表达于所有检测的组织中,包括外周血、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、淋巴结和皮肤,其中在肺脏、淋巴结和小肠中表达量最高,心脏、脾脏、肾脏和皮肤次之,外周血和肝脏的表达量最少。此外,为了研究pDHX15的亚细胞定位,将构建的与EGFP标签融合表达的pDHX15真核表达载体pEGFP-pDHX15分别与靶向定位于细胞核、内质网、高尔基体和线粒体的红色荧光质粒共转染HEK293T细胞,24h后用激光共聚焦显微镜确定pDHX15的亚细胞定位。结果显示,在转染pEGFP-pDHX15的HEK293T细胞内,带有绿色荧光的pDHX15弥散性的分布于整个细胞内,能够分别与细胞核、内质网、线粒体、高尔基体靶向定位的红色荧光重叠。3.pDHX15在诱导I型干扰素产生中的作用为了研究pDHX15在诱导I型干扰素产生中的作用,将构建的真核表达载体pCAGGS-HA-pDHX15、pCAGGS-pDHX15-△DUF、pCAGGS-pDHX15-△DUF-△HA2以及pCAGGS-pDHX15-DEXDc分别与猪源IFN-β启动子以及转录调控元件IRF3和NF-κB荧光素酶报告质粒共转染HEK293T细胞。结果显示,在poly(I:C)刺激下,pCAGGS-HA-pDHX15以剂量依赖的方式显著活化转录因子IRF3、NF-κB以及IFN-β的产生;当用siRNA敲降pDHX15后,能够显著降低poly(I:C)诱导IRF3和NF-κB以及IFN-β的活化。此外,pDHX15结构域缺失突变显示,DUF结构域和HELIC酶活性结构域属于负向调控结构域,能够负调节poly(I:C)诱导IRF3和NF-κB以及IFN-β的激活。但是,HA2结构域和DEXD结构域是正向调控结构域,能够正调节poly(I:C)诱导IRF3、NF-κB以及IFN-β的产生。进一步研究发现,pDHX15以剂量依赖的方式通过招募关键接头分子VISA和MITA激活IRF3和NF-κB,进而诱导IFN-β的表达。综上,pDHX15是猪的一个天然免疫RNA识别受体,在诱导I型IFNs的产生中具有重要作用。