环境激素,又称环境内分泌干扰物（EDCs）,其在环境介质中广泛存在,并在环境介质的迁移转化过程中通过直接或间接方式进入动物体和人体,干扰正常的生理功能甚至导致各种内分泌疾病、癌症的发生和发展。与传统污染物不同,环境激素在很低浓度暴露下亦能对人体健康和生态环境安全造成严重影响,并表现出明显的低剂量、非线性效应。环境激素的生物学效应评估方法包括动物模型和体外细胞模型。动物模型主要通过分析EDCs对动物病理学特征研究其危害,但其周期较长、成本较高且生物个体差异性较大。体外细胞模型则以细胞为研究载体,可较好地解决因个体差异以及生物体维持内稳态倾向所造成的敏感性降低问题,同时能方便进行极短时间环境激素暴露的低剂量非线性效应及其产生机理研究。一般地,EDCs通过基因组途径和非基因组途径发挥生物学作用。基因组途径中,EDCs通过结合核雌激素受体（nERs）并调节下游基因转录,最终影响细胞的增殖、侵袭、周期和凋亡等生物学行为,nERs主要包括雌激素受体alpha 66（ERα66）和雌激素受体beta（ERβ）。非基因组途径则主要由膜雌激素受体（mERs）介导,并通过激活下游信号通路调节细胞的生物学行为,mERs主要包括雌激素受体alpha 36（ERα36）和G蛋白偶联雌激素受体30（GPR30）。然而,环境介质中存在各种各样的EDCs,且不同EDCs在化学结构、受体特征方面存在或多或少的差异,导致其介导的效应也有所差别,因此研究EDCs的复合暴露效应是当前亟需探索的问题。基于此,本研究选取雌二醇（E2）、睾酮（TEST）、他莫昔芬（TAM）、柚皮素（Nar）、双酚A（BPA）和邻苯二甲酸二丁酯（DBP）作为EDCs的代表物质。基于分子生物学的研究方法,全面系统地分析不同EDCs单一暴露下的低剂量、非线性效应;在此基础上,通过检测细胞迁移、细胞周期、细胞凋亡、活性氧（ROS）生成和氧化应激酶活性等相关指标,分析了不同EDCs复合暴露对雌激素敏感且受体表达不同的4种细胞（MCF-7、SKBR3、MDA-MB-231和HepG2）的生物学作用;最后通过蛋白免疫印迹（WB）和实时荧光定量PCR（RT-QPCR）分析了细胞内不同雌/雄激素受体的表达及其相对比例变化,从蛋白和核酸分子水平分析了EDCs诱导细胞生物学行为变化及其效应机制。主要研究结论如下:（1）以雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌MCF-7细胞为体外研究模型,探讨了TAM对E2诱导的MCF-7细胞增殖的影响。结果表明,（1）E2在10^-1110^-66 M浓度范围内显著诱导MCF-7细胞增殖并呈现“倒U”型剂量-效应关系,而TAM在10^-95×10^-55 M浓度范围内均抑制MCF-7细胞的增殖,并呈现剂量依赖性;（2）TAM（5×10^-55 M）可通过抑制生理浓度E2(10^-1010^-88 M)诱导的MCF-7细胞迁移、细胞周期G1/S期转化及细胞凋亡抑制,最终降低E2诱导的MCF-7细胞增殖效应。（2）采用MCF-7体外模型研究了TAM-Nar复合暴露的抗增殖效应及机制。Nar单一暴露下,低浓度Nar（≤10^-44 M）促进MCF-7细胞增殖,而高浓度Nar（>10^-44 M）抑制MCF-7细胞增殖。高浓度TAM-Nar复合暴露通过（1）降低细胞迁移调节蛋白MMP-9和MMP-2的表达,抑制细胞迁移;（2）降低细胞周期调节蛋白Cyclin D和Cyclin E的表达,诱导细胞周期G2/M期阻滞;（3）上调p21和p53表达,并降低Bcl-2/Bax比例,诱导细胞凋亡;（4）诱导胞内ROS生成,最终协同抑制MCF-7细胞增殖。ERα66、ERβ、ERα36和GPR30共同参与TAM-Nar复合暴露诱导的MCF-7细胞抗增殖效应,即（1）调节雌受体表达水平:下调ERα66、ERα36和GPR30的表达,上调ERβ表达;（2）改变雌激素受体之间的比例:降低ERα66/ERβ和ERα66/ERα3比例,增加ERβ/ERα36、ERβ/GPR30和ERα36/GPR30比例。（3）采用SKBR3和MDA-MB-231体外模型研究了Nar对雌激素受体阴性（ER–）乳腺癌细胞的双向剂量-效应及其机制。与ER+乳腺癌MCF-7细胞类似,Nar对ER–乳腺癌细胞的增殖活性也表现为“倒U”型剂量-效应关系。其中,低浓度Nar通过（1）下调E-cadherin表达,上调N-cadherin、MMP-9和MMP-2表达,促进细胞迁移;（2）降低ROS生成,下调Bax、p21和p53蛋白表达,上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达,抑制细胞凋亡,最终促进细胞的增殖过程。高浓度Nar则通过下调N-cadherin、MMP-9和MMP-2表达,上调E-cadherin表达,抑制细胞迁移;（2）调节细胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D和Cyclin E表达,诱导细胞S期或G2/M期阻滞;（3）下调Bcl-2表达,上调Bax、p21和p53蛋白表达,诱导细胞凋亡;（4）促进胞内ROS生成,最终抑制细胞增殖。ER–乳腺癌细胞中ERα36和GPR30激活参与Nar的抗增殖、促凋亡过程。（4）成功构建了一株TAM耐药性MCF-7细胞（TamR-MCF7）,经验证其耐药性浓度介于10^-66 M和2×10^-66 M之间。细胞周期和凋亡分析表明MCF-7细胞可通过逃避细胞周期G0/G1期阻滞和细胞凋亡产生TAM耐药性;同时,TAM耐药性产生与胞内ERα66、ERβ、ERα36和GPR30四种雌激素受体的表达水平及其相对比例相关。相对于MCF-7细胞,TamR-MCF7细胞中ERα66、ERβ表达显著下调而ERα36和GPR30表达显著上调;ERα66/ERβ和ERα36/GPR30显著上调。特别地,生理浓度E2可显著诱导TamR-MCF7细胞增殖,且其促增殖效应强于MCF-7细胞。（5）采用MCF-7体外模型研究了DBP和BPA两种典型环境类雌激素的联合效应及机制。单一暴露下,低浓度DBP和BPA(10^-710^-55 M)可促进MCF-7细胞增殖,而高浓度DBP和BPA（10^-44 M）则诱导细胞凋亡;DBP和BPA复合暴露在低浓度下其联合作用模式表现为加和作用,而在高浓度下表现为拮抗作用;低浓度DBP和BPA单一或复合暴露促进细胞增殖,其与推进细胞周期从G0/G1期向S期、G2/M期转化,以及上调ERα66和GPR30表达相关;高浓度DBP和BPA单一或复合暴露则通过ROS增加、G0/G1期阻滞和ERα66 mRNA转录抑制等方式诱导细胞凋亡。（6）采用HepG2体外模型研究生理浓度E2-TEST复合暴露的抗增殖效应及机制。E2和TEST单一暴露对HepG2细胞增殖均表现为“倒U”型剂量-效应关系,且在生理浓度范围内均诱导细胞增殖,E2对HepG2的促增殖效应较TEST强。生理浓度E2-TEST复合暴露能抑制HepG2细胞增殖,并呈现时间依赖性,其主要通过（1）降低细胞周期调节蛋白Cyclin D和Cyclin E表达,诱导细胞周期G0/G1期阻滞;（2）降低Bcl-2/Bax比例,诱导细胞凋亡（早期凋亡为主）,最终抑制HepG2细胞增殖。ERα66、ERβ、ERα36和AR四种受体的表达水平及其比例变化参与E2-TEST复合暴露诱导的HepG2细胞抗增殖效应,即E2-TEST复合暴露（1）下调ERα36和AR表达,上调ERα66和ERβ表达;（2）降低ERα66/ERβ、ERα66/ERα36和ERβ/ERα36比例,增加ERα66/AR、ERα36/AR和ERβ/AR比例。以上研究借助体外模型,系统研究了多种典型EDCs对不同激素敏感性肿瘤细胞模型的低剂量非线性效应及复合暴露效应,其将分子生物学与环境毒理学效应相结合,从分子水平研究了其生物学作用机制,为环境激素的健康风险评估以及肿瘤的预防和治疗提供了必要的理论依据和数据支撑。