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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见于中老年人的神经退行性疾病。其病理特征是黑质(substantia nigra,SN)多巴胺能神经元的选择性脱失,从而导致纹状体多巴胺(dopamine,DA)含量减少,以及残存神经元内出现以alpha-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)为主要成分的路易小体(Lewy bodies,LBs)。PD的发病机制包括炎症反应,氧化应激,SN铁的异常沉积,蛋白质异常聚集以及线粒体功能障碍等。近年来,越来越多的研究显示肠道菌群与PD的发病密切相关。Sampson等人利用过表达α-syn小鼠,发现肠道菌群失调参与调节运动障碍、小胶质细胞激活等病理性过程,将PD患者肠道菌群移植到α-syn过表达小鼠中,其损伤会增强。肠道菌群与宿主健康密不可分。在大多数情况下,肠道菌群的数量和种类在不同时期处于相对平衡的状态,可以保护宿主不受病原菌的侵害。但是细菌的组成受到许多因素的影响,尤其是饮食成分包含金属离子。饮食结构决定了肠道细菌的微环境,进而影响了微生物的多样性。铁是细菌生长必不可少的重要因素之一。当机体铁摄入过多时,会破坏肠道菌群的平衡,更有利于致病性肠道细菌的生长而抑制肠道有益屏障细菌的生长。此外,铁水平与许多病原体和条件致病菌的毒力直接相关。研究显示食用富含铁食物的人群患PD的危险性增加1.7倍。动物研究发现,新生小鼠过多摄入外源性铁会导致多巴胺能神经元的变性。本实验室前期研究发现,给予成年雄性小鼠高铁饮食后,其SN区铁含量增加,酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)减少,但其确切机制仍不清楚。基于以上的研究背景,我们提出假说:高铁饮食导致的SN铁含量增加以及多巴胺能神经元损伤可能与高铁饮食造成的肠道菌群失调有关。因此,本实验我们将以8周龄雄性C57BL/6小鼠为研究对象,给予3%羰基铁粉高铁饮食,观察高铁饮食对黑质铁含量、多巴胺能神经元以及小鼠肠道菌群的影响。我们应用细菌16S r DNA序列扩增和Mi Seq高通量测序技术检测高铁饮食对肠道菌群的影响;应用气相层析-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技术检测粪便短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)含量;采用免疫组织化学方法观察SN中酪氨酸羟化酶免疫反应阳性(tyrosine hydroxylase immunoreactive,TH-ir)神经元的数量变化;Perls’铁染色方法观察SN中铁染色阳性细胞的变化;免疫荧光染色观察SN中小胶质细胞标记物离子钙结合衔接分子1(ionized calcium-binding adaptor molecule 1,Iba1)的表达变化;蛋白质免疫印迹方法观察SN中TH蛋白表达变化;酶联免疫吸附法观察血清和粪便中细菌LPS含量。为了探究SN区多巴胺能神经元损伤和铁沉积是否与小鼠肠道菌群失调有关。我们利用粪便菌群移植(Fecal microbiota transplantation,FMT)将高铁饮食小鼠(供体小鼠)粪便悬浮液移植到抗生素预处理小鼠(受体小鼠)体内。采用免疫组织化学和Perls’铁染色方法观察小鼠SN区TH-ir神经元的数量变化和SN中铁染色阳性细胞的变化。具体结果如下:1.高铁饮食对小鼠肠道菌群的影响(1)肠道菌群alpha多样性分析。高铁饮食1月和3月组与正常饮食组相比,H指数显著增加(***P<0.001,*P<0.05,n=8-10),D指数显著减少(***P<0.001,*P<0.05,n=8-10),差异具有统计学意义,说明高铁饮食1个月和3个月菌群多样性增加。高铁饮食2周组H指数和D指数未见明显变化(P>0.05,n=10)。(2)基于OTU的beta多样性分析。高铁饮食组和正常饮食组样本均分布在不同的区域,两组之间显著分离。高铁饮食1月和3月组其样本更加显著的聚集;高铁饮食2周组不同样本没有表现出明显的聚集情况。(3)基于门分类水平的菌群物种丰度差异分析。高铁饮食2周组,与正常饮食组相比变形菌门(Proteobacteria)(*P<0.05,n=10)、柔膜菌门(Tenericutes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)(**P<0.01,n=10)物种丰度显著增加,差异具有统计学意义。高铁饮食1月组,与正常饮食组相比拟杆菌门(Bacteroidetes)物种丰度显著减少(***P<0.001,n=10);厚壁菌门(Firmicutes)、Proteobacteria、Tenericutes(**P<0.01,n=10),蓝藻门(Cyanobacteria)、Verrucomicrobia(*P<0.05,n=10)和放线菌门(Actinobacteria)(***P<0.001,n=10)物种丰度显著增加,差异具有统计学意义。高铁饮食3月组,与正常饮食组相比Firmicutes物种丰度显著减少(*P<0.05,n=8);Bacteroidetes、Verrucomicrobia(*P<0.05,n=8)和Cyanobacteria(**P<0.01,n=8)物种丰度显著增加,差异具有统计学意义。(4)基于属分类水平的菌群物种丰度差异分析。高铁饮食2周组与正常饮食组相比,拟杆菌属(Bacteroides)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、拟普雷沃氏菌属(Alloprevotella)、另枝菌属(Alistipes)、大肠埃希氏菌属(Escherichia)、副萨特氏菌属(Parasutterella)、丹毒丝杆菌属(Erysipelatoclostridium)丰度显著增加(***P<0.001,**P<0.01,*P<0.01,n=10);假单胞菌属(Pseudomonas)丰度显著降低(*P<0.05,n=10),差异具有统计学意义。高铁饮食1月组,Bacteroides、Parabacteroides、Escherichia、Intestinimonas、瘤胃球菌属(Ruminococcus)瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium)、肠杆菌属(Enterorhabdus)、乳球菌属(Lactococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、Pseudomonas和布劳特氏菌属(Blautia)丰度较正常饮食组显著增加(***P<0.001,**P<0.01,*P<0.01,n=10);理研菌属(Rikenella)丰度较正常饮食组显著减少(*P<0.05,n=10),差异具有统计学意义。高铁饮食3月组,与正常饮食组相比Bacteroides、Parabacteroides、Alloprevotella)、Escherichia、Intestinimonas、Erysipelatoclostridium、颤杆菌克属(Oscillibacter)、Lactococcus和Blautia丰度显著增加(***P<0.001,**P<0.01,*P<0.01,n=8);乳酸菌属(Lactobacillus)、Pseudomonas和Allobaculum丰度显著减少(***P<0.001,**P<0.01,*P<0.01,n=8),差异具有统计学意义。2.高铁饮食2周组,与正常饮食组相比,乙酸含量显著降低(*P<0.05,n=10),己酸和异戊酸含量显著升高(**P<0.01,n=10),差异具有统计学意义。高铁饮食1月组,与正常饮食组相比,戊酸(**P<0.01,n=10)、己酸(*P<0.05,n=10)含量显著降低,异丁酸(***P<0.001,n=10)含量显著升高,差异具有统计学意义。高铁饮食3月组,与正常饮食组相比,乙酸、丁酸含量显著降低(*P<0.05,n=8),差异具有统计学意义。3.高铁饮食1月和3月组,小鼠血清LPS含量与正常饮食组相比显著升高(***P<0.001,n=6),差异具有统计学意义。粪便细菌LPS含量高铁饮食组与正常饮食组相比各组差异均无明显变化(P>0.05,n=6)。4.高铁饮食3月组小鼠SN区TH-ir神经元数量与正常饮食组相比显著减少(**P<0.01,n=6),差异具有统计学意义;高铁饮食2周和1月组差异无明显变化(P>0.05,n=6)。5.高铁饮食3月组小鼠SN区TH蛋白表达与正常饮食组相比显著下降(*P<0.05,n=6),差异具有统计学意义;高铁饮食2周和1月组未见明显变化(P>0.05,n=6)。6.高铁饮食1月和3月组小鼠SN区铁染色阳性细胞计数与正常饮食组相比显著增多(*P<0.05,**P<0.01,n=6),差异有统计学意义;高铁饮食2周组未见明显变化(P>0.05,n=6)。7.高铁饮食3月组小鼠SN区小胶质细胞标记物Iba1染色阳性细胞计数与正常饮食组相比显著增多(*P<0.05,n=5),差异具有统计学意义;高铁饮食2周和1月组未见明显变化(P>0.05,n=5)。8.粪菌移植组和高铁饮食组小鼠SN区TH-ir神经元数量与正常饮食组相比显著减少(*P<0.05,n=5),差异具有统计学意义;抗生素预处理组与正常饮食组相比未见明显变化(P>0.05,n=5)。粪菌移植组和高铁饮食组小鼠SN区TH-ir神经元数量与抗生素预处理组相比显著减少(##P<0.01,n=5),差异具有统计学意义。粪菌移植组与高铁饮食组相比未见明显变化(P>0.05,n=5)。9.粪菌移植组和高铁饮食组小鼠SN区铁染色阳性细胞计数与正常饮食组相比显著增多(*P<0.05,**P<0.01,n=5),差异具有统计学意义;抗生素预处理组与正常饮食组相比未见明显差异(P>0.05,n=5)。粪菌移植组和高铁饮食组小鼠SN区铁染色阳性细胞计数与抗生素预处理组相比显著增多(#P<0.05,##P<0.01,n=5),差异具有统计学意义。粪菌移植组与高铁饮食组相比未见明显差异(P>0.05,n=5)。上述结果表明,高铁饮食1个月和3个月可以引起小鼠肠道菌群失调,肠道菌群多样性增加,优势菌门拟杆菌门和厚壁菌门丰度比例改变,能够降低对肠道有益的肠道菌群代谢物乙酸和丁酸含量;能够引起SN小胶质细胞的激活,血清LPS含量升高,造成SN区TH-ir神经元的减少和铁沉积。高铁饮食造成的SN区铁的沉积和多巴胺能神经元的减少可能与肠道菌群失调有关。