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目的:1、检测慢病毒载体介导的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶/单纯疱疹病毒胸苷激酶(CD/TK)双自杀基因在大鼠乳腺癌SHZ-88细胞中的表达情况和对乳腺癌细胞的杀伤效应与旁观者效应。2、评估经动脉灌注重组慢病毒转染SD大鼠游离腹壁浅动脉穿支(SIEA)皮瓣后CD/TK基因在皮瓣内的表达情况。3、探讨CD/TK双自杀基因过表达慢病毒体系联合前药5-氟胞嘧啶与更昔洛韦(5-FC+GCV)对大鼠乳腺癌移植瘤生长的抑制情况。4、探讨游离皮瓣在感染CD/TK双自杀基因过表达慢病毒体系后是否会产生全身性的毒副反应。方法:1、将扩增后的载体质粒(目的质粒或空载质粒)、慢病毒包装质粒与包膜质粒共转染HEK293T感受态细胞,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,将细胞上清液高速离心以浓缩纯化病毒,将浓缩的慢病毒10倍梯度稀释后感染HEK 293T细胞,观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况,根据下列公式计算重组慢病毒的滴度:病毒滴度=表达荧光蛋白的细胞数/病毒原液量。2、分别将不同感染复数(MOI)的LV-CD/TK与LV-GFP重组慢病毒感染SHZ-88细胞,测定慢病毒对细胞的感染效率;采用CCK-8检测感染慢病毒后SHZ-88细胞的生长曲线;通过RT-PCR与western blot检测感染慢病毒体系后的SHZ-88细胞中CD/TK基因的表达情况;将不同浓度的5-FC与GCV单独或联合加入感染慢病毒后的SHZ-88细胞中,通过CCK-8与MuseTM Cell Analyzer检测细胞的增殖、凋亡和周期的变化情况;将一定浓度的5-FC与GCV联合加入感染慢病毒后的SHZ-88细胞中,随后收集细胞上清,并加入到正常的SHZ-88细胞中,通过CCK-8检测细胞的增殖情况。3、解剖SD大鼠的SIEA皮瓣以了解局部血管的关系与走行;经股动脉-腹壁浅动脉途径灌注甲紫溶液以观察腹壁浅动脉的供血范围;将SHZ-88细胞接种于SIEA皮瓣的皮下,观察皮瓣的成活情况以及移植瘤的生长情况。4、切取并游离SD大鼠的SIEA皮瓣,经股动脉-腹壁浅动脉途径灌注重组慢病毒溶液或PBS,体外孵育1h后原位移植SIEA皮瓣,术后第7天通过RT-PCR与western blot检测CD/TK基因在SIEA皮瓣、受植创面与各脏器(心、肝、肺、肾、脾与小肠)中的表达情况。同上将重组慢病毒溶液或PBS经动脉灌注SIEA皮瓣,原位移植皮瓣后,将SHZ-88细胞接种于SIEA皮瓣的皮下,术后30天内每天经腹腔注射前药5-FC+GCV,定期测量移植瘤体积,绘制生长曲线。每周抽取SD大鼠静脉血检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)与天门冬氨基酸转移酶(AST)水平的变化情况。术后第42天切取瘤体,称重并计算抑瘤率,将瘤体与各脏器标本行HE染色观察组织病理学变化。结果:1、CD/TK重组慢病毒的包装与滴度测定:(1)将三质粒共转染HEK 293细胞48h后,95%以上的细胞都表达绿色荧光蛋白,说明HEK 293细胞对重组慢病毒的包装过程顺利,包装效果显著。(2)测定病毒滴度,当病毒原液量为10-5μ1时,CD/TK重组慢病毒组与空载慢病毒组中分别可见2个与1个带绿色荧光的细胞,经计算,CD/TK重组慢病毒与空载慢病毒的滴度分别为2E+8TU/ml与1E+8TU/ml。2、CD/TK双自杀基因联合前药对SHZ-88细胞的直接杀伤效应与旁观者效应:(1)CD/TK重组慢病毒对SHZ-88细胞的感染情况与空载慢病毒相似,随着慢病毒MOI的增加,GFP阳性细胞增加,荧光亮度增强,当MOI=100时,95%以上的细胞表达GFP,经CCK-8检测发现MOI 100以内的病毒液对细胞生长无明显影响;当MOI=200时,几乎所有细胞表达GFP,但是病毒液对细胞有毒性,抑制细胞的生长。(2)通过RT-PCR与western blot检测发现,感染LV-CD/TK的SHZ-88细胞中出现CD/TK融合基因mRNA水平与蛋白水平的表达,而感染LV-GFP或未感染病毒的SHZ-88细胞中未发现CD/TK基因的表达。(3)实验组的SHZ-88细胞对前药5-FC+GCV具有较高的敏感性,细胞的存活率随前药浓度的增高而逐渐下降,呈剂量-效应关系(P<0.001),并且联用前药5-FC+GCV时,该组细胞的存活率明显低于单用前药GCV或5-FC时(P<0.01);而阴性对照组与空白对照组的细胞生长未受明显抑制。在给予前药5-FC+GCV处理后,实验组SHZ-88细胞的凋亡率以及细胞周期中处于G1期的比率均明显高于阴性对照组与空白对照组的细胞(P<0.01)。(4)实验组经前药5-FC+GCV处理后的细胞上清液可显著抑制正常SHZ-88细胞的生长(P<0.001),而阴性对照组与空白对照组的细胞上清对正常SHZ-88细胞的生长无明显影响。3、SD大鼠SIEA皮瓣的血供系统与体内的成瘤效果:(1)经解剖SD大鼠SIEA皮瓣发现,股动脉自腹股沟处向外走行约1.4cm后可恒定发出腹壁浅动脉分支支配SIEA皮瓣。甲紫溶液经股动脉-腹壁浅动脉途径灌注后在SIEA皮瓣内的分布范围超过2.5cm×2.5cm。(2)将SHZ-88细胞接种于SIEA皮瓣的皮下后,皮瓣成活良好,乳腺癌移植瘤生长速度平稳。4、CD/TK重组慢病毒灌注SIEA皮瓣联合前药对SD大鼠乳腺癌模型的疗效观察:(1)SD大鼠SIEA皮瓣经动脉灌注病毒液或PBS后第7天,通过RT-PCR与western blot检测发现,实验组SIEA皮瓣的蒂部、近蒂端与远蒂端均有CD/TK融合基因mRNA水平与蛋白水平的表达,而阴性对照组与空白对照组的皮瓣内、实验组的受植创面上以及各脏器(心、肝、肺、肾、脾与小肠)内均未见CD/TK基因的表达。(2)SD大鼠的SIEA皮瓣经动脉灌注病毒液或PBS,皮瓣皮下接种SHZ-88细胞,连续腹腔注射前药5-FC+GCV 30天后,各组中瘤体最终体积、最终瘤重与抑瘤率结果分别为:实验组:104.00±7.53mm3,122.25±6.93mg,83.02%;阴性对照组:690.10±41.95mm3,693.56±26.91mg,3.70%;空白对照组:706.57±21.22mm3,720.17±23.15mg,差异有统计学意义(P<0.01)。可见,与阴性对照组、空白对照组相比较,实验组的移植瘤生长受到明显抑制;通过HE染色发现,实验组的瘤体内可见明显的变性坏死灶,而阴性对照组与空白对照组的瘤体未见明显变化。(3)定期抽取SD大鼠静脉血检测发现实验组、阴性对照组与空白对照组血清中的ALT与AST水平在术后42天内未见大幅度的波动。通过HE染色发现,实验组的各脏器内均无明显的炎性细胞的浸润,也未发现SHZ-88大鼠乳腺癌细胞的转移。结论:1、利用三质粒包装法可顺利包装CD/TK双自杀基因过表达慢病毒体系以及空载慢病毒体系。2、LV-CD/TK感染SHZ-88细胞后,CD/TK双自杀基因可在细胞内有效表达;CD/TK双自杀基因系统联合前药5-FC+GCV可显著杀伤SHZ-88大鼠乳腺癌细胞,有效诱导细胞凋亡,引起乳腺癌细胞周期G1期阻滞,并且在联用前药5-FC+GCV时对SHZ-88细胞的杀伤效应明显优于单用前药GCV或5-FC时,此外,CD/TK双自杀基因系统联合前药5-FC+GCV对SHZ-88细胞可产生明显的旁观者效应。3、SD大鼠的SIEA皮瓣具有稳定的供血系统,腹壁浅动脉供血范围超过2.5cm×2.5cm;SHZ-88大鼠乳腺癌细胞在SD大鼠SIEA皮瓣的皮下成瘤效果稳定,重复性好。4、LV-CD/TK可经股动脉-腹壁浅动脉途径灌注大鼠SIEA皮瓣,术后7天CD/TK双自杀基因在SIEA皮瓣内有效表达,而在受植创面以及各脏器内未见明显表达;CD/TK双自杀基因联合前药5-FC+GCV对大鼠乳腺癌移植瘤的生长具有抑制作用,但是对SD大鼠未产生明显的全身性毒副反应。