研究背景和目的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)属于革兰氏阴性菌,它在自然界的分布十分广泛,是导致人类疾病的最重要的条件致病菌之一。尤其在呼吸系统感染疾病中最为常见,而且是呼吸机肺炎和获得性感染的重要病原体。由于目前抗生素滥用问题十分严重,铜绿假单胞菌的耐药率呈现逐年提高的趋势,由于铜绿假单胞菌极易生成生物被膜(Biofilm)从而逃避免疫系统攻击,也降低了抗生素疗效;并可通过基因突变、获得外源耐药基因、外排泵等多种方式导致对青霉素类、先锋霉素类、碳青霉烯类、单菌霉素、氨基糖甙类、多粘菌素类和氟喹诺酮类抗生素耐药甚至是泛耐药。面对严峻的耐药形势,除了开发新型抗生素以外,目前研究方向有“老药新用”和“利用共生菌抑制致病菌”等方法,但存在新药开发周期长、新技术应用范围窄等缺点,因此急需简便易行有效的方法来改善抗生素疗效。我们发现,致病菌感染部位的内环境在感染控制与治疗过程中起到了关键作用。然而,以往的耐药研究多集中在体外,而人体内环境对致病菌耐药性的影响却知之甚少。由于感染部位的表面性质、基础疾病以及pH值都会对细菌生理活动甚至是耐药性产生影响。为了达到通过改变感染部位内环境提高抗生素治疗效果,因此必须在感染环境中研究致病菌耐药性和致病性的影响及并探讨其分子机制。pH值对维持人体正常生理活动至关重要,为了维持组织的正常生理功能,内环境一般具有稳定的pH值。在临床上多种疾病能够导致气道内及体液中的pH值发生改变,这种改变将会对定植在气道表面的病原微生物产生作用,影响抗生素的抑菌活性、生物被膜生成以及毒力因子的分泌,但pH值的改变如何影响以上致病性相关表型?这一过程中有哪些关键基因或蛋白参与?如何通过改变环境pH提高感染状态下抗生素疗效?对于以上问题目前尚无明确结论。为了揭示铜绿假单胞菌在不同pH值条件下耐药特征的一般规律,发现不同pH值对影响铜绿假单胞菌耐药与生物被膜生成的关键调控分子,进而通过改善内环境来提高抗生素治疗效果,本研究利用微生物学、分子生物学以及RNA-seq等现代技术,通过模拟呼吸道中的pH值,对铜绿假单胞菌耐药特征与基因背景的相关性进行深入分析与研究,10揭示pH值对铜绿假单胞菌毒力分泌、被膜生成等致病因素的作用规律,为提高抗生素治疗效果、延缓或逆转铜绿假单胞菌耐药及抑制生物被膜生成提供重要理论支持。研究方法首先,本研究收集了102株经生化鉴定和16S r RNA测序验证的铜绿假单胞菌,来自2家医院的住院患者。同时对患者性别、年龄、入院前使用抗生素等基本信息进行统计。利用M-H琼脂平板倍比稀释法测定抗菌药物的MIC,随后用多位点序列分型(MLST)技术对102株铜绿假单胞菌分型。利用PCR技术对IMP、VIM、NDM等碳青霉烯酶基因进行检测,最后对β-内酰胺类抗生素耐药但MBL阴性的铜绿假单胞菌opr D基因进行PCR扩增和测序,并对生物被膜的生成情况进行监测。接着,我们在pH5.6,pH6.2,pH6.8和pH7.4下绘制了铜绿假单胞菌标准株PAO1的生长曲线,研究了pH值对PAO1生长情况的影响。利用分光光度计测定了生物被膜生成以及毒力因子浓度。利用微量肉汤稀释法检测了在上述pH下头孢他啶、头孢哌酮、庆大霉素、妥布霉素、左氧氟沙星和环丙沙星的药敏情况。然后利用102株铜绿假单胞菌临床分离株对MIC结果进一步验证。然后,我们对pH6.8和pH7.4下培养的铜绿假单胞菌标准株PAO1和1株临床分离株依次进行了样本转录组测序,通过m RNA的提取、反转录、片段化、添加接头和引物序列、测序、数据质控、差异基因分析、GO富集分析、KEGG通路分析,研究了在不同pH条件下参与了铜绿假单胞菌差异表达基因和信号通路富集情况,并且分析了耐药表型和生物被膜生成与其基因背景之间的关系。。最后,将realtime PCR进行验证过的差异基因,利用基因敲除构建了基因缺失株,研究了在感染的特定pH环境下与耐药相关的关键基因,并对耐药表型、毒力因子释放以及被膜生成的影响进行研究。主要研究结果在对102位铜绿假单胞菌感染患者资料统计中我们发现:患者年龄(>60周岁)、入院前使用抗生素、使用导尿管和住院天数延长(>15d)都可能是本研究中铜绿假单胞菌感染的风险因素。MIC测定结果发现这102株铜绿假单胞菌对β-内酰胺类、喹诺酮类抗生素耐药率相对较高,其中亚胺培南耐药率为23.5%、美罗培南耐药率为19.6%、头孢哌酮和环丙沙星为17.6%、左氧氟沙星为18.6%;而对哌拉西林/他唑巴坦耐药率相对较低,仅为8.8%。通过MLST分子分型,我们发现这102株菌分为25个基因型,其中ST235型和ST111型最为普遍,两种基因型分别有32株和15株,ST235型的耐药谱最广。102株铜绿假单胞菌中有25株对碳青霉烯类耐药,其中只有6株为碳青霉烯酶(MBLs)11耐药基因阳性,其中包括4株菌IMP基因阳性,1株菌VIM基因阳性和1株KPC阳性。这6位患者其中5位在入院前使用过抗生素。此外在其余19株碳青霉烯耐药但MBL阴性的铜绿假单胞菌中有18株发生了opr D基因的突变失活,结果提示opr D基因突变可能是本研究中铜绿假单胞菌耐药的主要原因。。本研究中发现了一株罕见的KPC阳性的铜绿假单胞菌,携带了一个新型非接合转移型质粒p10265-KPC,推测该质粒由p COL-1、p10265-KPC和p KT048三个质粒通过一系列遗传学事件最终进化产生,说明耐药基因和质粒在传递过程中可产生新的组合,使细菌产生新的耐药表型或导致泛耐药株的出现流行。在pH值对铜绿假单胞菌致病性与抗生素敏感性影响的研究中我们发现:酸性环境(pH5.6)不仅对铜绿假单胞菌PAO1生长起到抑制作用,而且对生物被膜的生成也具有抑制作用,而在pH6.8与弱碱性环境(pH7.4)下对铜绿假单胞菌PAO1生长的影响并不显著。对于毒力因子分泌的研究中,我们发现蛋白水解酶和弹性蛋白酶在铜绿假单胞菌培养上清中的浓度随着pH值的提高而提高;绿脓菌素浓度在pH5.6到pH6.8之间随着pH值的提高而增高,当pH超过中性环境达到7.4时,开始出现下降的趋势;随pH的提高,鼠李糖脂毒素的浓度总体呈现下降趋势。在对抗生素敏感性的研究中,我们发现在弱碱性条件下(pH7.4)能够提高喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素的对PAO1的抑菌效果,而在酸性条件(pH5.6)提高了β-内酰胺类对PAO1的抑菌效果。为了进一步验证pH对抗生素抑菌活性的影响,我们还使用了102株临床分离铜绿假单胞菌进行试验,发现在酸性条件(pH5.6)能够促进β-内酰胺类抗生素对铜绿假单胞菌的抑菌效果;不同的氨基糖甙类抗生素抑菌效果随pH值变化的趋势不同,总体来说弱碱性环境(pH7.4)下增强了对铜绿假单胞菌的抑菌活性;而对于喹诺酮类抗生素,本研究使用的环丙沙星和左氧氟沙星MIC随pH值的提高变化趋势相反,其中环丙沙星抑菌活性值随pH值的提高而增强,但左氧氟沙星抑菌活性随pH的提高而降低。随后,我们利用RNA-seq技术研究在pH6.8和pH7.4条件下对铜绿假单胞菌转录组差异表达基因进行了研究。首先经过数据质量控制与过滤,将测序质量值、ATGC比例、饱和度和均一度控制在可以接受的范围。我们发现:在pH6.8下的PAO1菌株共测得21,274,034条reads,在pH7.4下的PAO1菌株共测得23,277,746条reads,通过序列回帖发现分别有20551918条reads(96.6%)和22324708条reads(95.9%)mapping(序列回帖)到基因组上。在多样品差异分析时发现pH 6.8相比pH7.4,下调基因略多于上调基因,差异表达最显著的上调基因主要参与细胞通透、RNA合成、蛋白转运与外排等生理功能;最显著的下调基因主要涉及脂类代谢通路和分泌系统功能。富集分析发现Ⅲ型分泌系统、转录调控功能、氧化还原功能、跨膜转运功能相关基因被显著富集。接着我们利用Real-time PCR技术对筛选的10个差异基因(5个上调基因,5个下调基因)进行验证,发现Real-time PCR在pH6.8相对pH7.4条件下表达量变化倍数与RNA-seq存在少许差异,但变化趋势完全一致。接下来,我们对表达量变化倍数符合度较高的基因:ant B和pmr A(均为上调基因)利用同源重组技术进行敲除,并研究了ant B基因和pmr A基因对药敏性、毒力因子分泌以及生物被膜生成的影响,我们发现ant B基因缺失株相比野生型提高了对β-内酰胺类抗生素(头孢他啶、头孢哌酮)的敏感性;pmr A基因缺失株提高了喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素的敏感性。上述两个基因对铜绿假单胞菌毒力因子释放影响不显著;此外我们首次发现ant B和pmr A基因缺失株在pH6.8条件的生物被膜抑制作用减弱。结论1.临床分离的铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物具有较高的耐药性,对哌拉西林/他唑巴坦敏感率最高,β-内酰胺酶和opr D基因的突变失活是铜绿假单胞菌碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。2.pH值的改变对铜绿假单胞菌生长、生物被膜的生成、毒力因子的分泌以及MIC值产生影响,研究发现,在弱酸性环境能够抑制铜绿假单胞菌生长和生物被膜的生成,提高了β-内酰胺类和氨基糖甙类抗生素的抑菌活性,抑制了了毒力因子蛋白水解酶和弹性蛋白酶的分泌;在弱碱性环境下,虽然对铜绿假单胞菌生长无明显影响,但能够抑制了绿脓菌素的分泌,提高了环丙沙星的抑菌活性。3.pH 6.8相比pH7.4,铜绿假单胞菌细胞通透性有所提高,而部分外排泵功能和分泌功能受到抑制。两种pH条件对毒力分泌、MIC改变、生物被膜生成的影响或许与铜绿假单胞菌III型分泌系统、转录调控功能、氧化还原功能、跨膜转运功能相关基因的表达量差异有关。4.ant B基因敲除提高了β-内酰胺类抗生素的敏感性;pmr A基因敲除提高了喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素的敏感性。ant B和pmr A基因缺失株在pH6.8条件的生物被膜抑制过程中具有重要作用。