五种典型中药材中黄曲霉毒素的污染状况检测及赭曲霉毒素免疫试纸条的制备和简单应用

来源 :吉林农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:myjob3
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中药中常见的真菌毒素主要有黄曲霉毒素(aflatoxins,AFs)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)、伏马菌素(fumonisins,FBs)、T-2毒素等。其中AFs与OTA是中药中较易污染的真菌毒素两者都属于人类致癌物,严重威胁着用药安全性。因此,针对常见中药材中真菌毒素的定量化检测及防霉变控制技术的研究至关重要。本论文主要研究:1.IAC-HPLC-FLD方法测定5种典型中药饮片中黄曲霉毒素采用IAC-HPLC-FLD方法,样品经70%甲醇提取、免疫亲和柱净化后,利用液相色谱分离-荧光检测中药饮片中4种黄曲霉毒素(AFB1,AFB2,AFG1和AFG2)的含量。通过优化前处理方法,使得此方法能同时满足5种中药饮片远志、柏子仁、决明子、党参、薏苡仁的检测要求。收集并检测5种中药饮片114批次,其中26批柏子仁(AFs 1.2246.67μg·kg-1,AFB1 1.2231.40μg·kg-1)、4批薏苡仁(AFs 1.9741.13μg·kg-1,AFB1 1.9736.40μg·kg-1)、1批决明子(AFs 13.65μg·kg-1,AFB1 12.60μg·kg-1)检出阳性、党参未检出、13批远志(AFs 2.40194.46μg·kg-1,AFB1 2.0390.04μg·kg-1),阳性率为41%,超标率为15%。2.远志初加工过程中黄曲霉毒素易发生关键环节的考察及脱除越来越多的研究报道出远志中黄曲霉毒素污染严重,但对其产生毒素的关键点及防霉变控制方面的研究较少。本章通过实地考察山西产地的远志的初加工过程,同时于实验室简单模拟远志产地初加工过程,包括埋土、发汗、抽芯等过程,检测在初加工的各个关键环节下黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2的产生状况;并将由初加工得到的远志饮片在28℃,湿度范围为82%90%和96%条件下分别进行储藏后一段时间后,测定毒素产生的情况,以此考察远志初加工-储藏过程中黄曲霉毒素的易污染环节。检测结果显示,远志在初加工各环节的样品检测结果均为阴性;其次2种湿度条件下储藏结果显示,当湿度为96%时,在7天的时间内远志发霉严重,并检测出了AFB1、AFs的含量分别为4.01μg·kg-1,5.36μg·kg-1。因此,将采收的远志鲜品进行及时处理和干燥,对远志真菌毒素污染的防控至关重要。以黄曲霉毒素含量高于限量(14号样品AFs,AFB1分别为159.44,68.66μg·kg-1)与与低于限量(39号样品AFs,AFB1分别为2.08,2.08μg·kg-1)的2个批次远志分别为进行黄曲霉毒素脱除研究。首先测定了在水洗及75%乙醇洗2种脱除方法下远志中黄曲霉毒素含量的变化,结果表明14号远志样品进行水洗和75%乙醇洗后对AFB1的脱除率分别为92.47%和64.01%;39号样品在水洗和75%乙醇洗后,黄曲霉毒素未检出,对AFB1的脱除率均为≤100%。其次测定了由饮片到颗粒剂的过程中毒素含量的变化,测得39号远志中AFS和AFB1,分别为60.61和11.97μg·kg-1,转移率分别为38.01%,17.43%;39号远志中未检出黄曲霉毒素,其转移率约为ND。3.柏子仁初加工过程中黄曲霉毒素易发生关键环节的考察及脱除中药柏子仁中毒素的脱毒是指采用物理、化学、生物等处理方法除去已受到污染的中药材表面或内部的毒素,中药在产地加工储藏中有效的监控将避免真菌毒素成为威胁人类健康的污染源。本章通过模拟柏子仁产地初加工过程,考察在不同初加工条件下各个关键环节下AFB1,AFB2,AFG1,AFG2的产生状况。结果表明模拟过程中的柏子仁未成品(处于初加工过程中某个环节的产品)未检出AFs,说明此加工过程不易被毒素污染。此外收集的隔年柏子仁未成品及柏子仁成品中AFs检测结果均超过限量,污染严重,说明药材基地在初加工的过程中,存在在得到柏子之前就已经被毒素污染或在储藏柏子的过程中被毒素污染这两种情况,更进一步说明了对中药加工初始环节监控的重要性。选取黄曲霉毒素毒素含量高于限量和低于限量的2个批次柏子仁样品(AFs,AFB1毒素初始含量分别为23.95和23.17μg·kg-1(1号样品);3.94和3.94μg·kg-1(2号样品))进行进一步毒素脱除实验,测定在水洗及75%乙醇洗2种脱除方法下,比较被AFs污染的柏子仁中毒素含量的变化,得到1号样品进行水洗和75%乙醇洗后对AFB1的脱除率分别为77.69%和≤100%,对AFs的脱除率分别为78.41%和≤100%;2号样品在水洗和75%乙醇洗后,2种脱除方式均无黄曲霉毒素检出,对AFB1、AFs的脱除率均为≤100%。4.OTA免疫试纸条的制备及简单应用以胶体金标记抗体作为探针,通过优化金标抗体的偶联比、重悬液体系、C线与T线浓度等条件,自组装基于竞争法原理检测OTA的胶体金免疫试纸条。抗体加入量为5μg,10 mM PBS(1%蔗糖,0.02%MgSO4,0.1%Tween 20)的重悬溶液体系下,采用NC140硝酸纤维素膜,肉眼检测限为2.5μg·mL-1,检测时间1020 min。并采用70%甲醇-水提取收集的中药材样品,探讨胶体金试纸条在不同中药基质下的测定影响,检测方法满足欧盟限量标准15μg·kg-1的要求。同时液质确证了免疫层析分析方法样品检测结果的准确性。
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