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TAM受体-Tyro3、Axl和Mer,组成受体酪氨酸激酶(RTK)一个独特的亚家族,为单次跨膜蛋白。TAM受体通过二大基本生物学功能(凋亡细胞的吞噬和先天性炎症免疫反应的抑制)来维护体内免疫内环境稳定。我们在本论文中主要针对Mer受体酪氨酸激酶(Mer TK)在脂磷壁酸(LTA)诱导炎症反应调控和金葡菌吞噬中的作用进行研究。一.Mer TK调控脂磷壁酸(LTA)诱导炎症反应的分子机制研究研究背景LTA和LPS分别代表嵌入在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁的二个主要的PAMP分子。目前,有研究证实Mer TK负性调控LPS诱导的炎症反应。然而,在LTA诱导的炎症反应中,Mer TK是否具有类似的作用及其潜在机制仍有待于阐明。研究目的1.LTA刺激RAW264.7巨噬细胞,研究TLR2促炎信号和Mer TK抗炎信号相关蛋白的表达。2.探讨Mer TK信号在LTA刺激RAW264.7巨噬细胞所诱导炎症反应中的作用及其潜在机制。研究方法1.Western Blot检测LTA刺激巨噬细胞中相关蛋白的表达用LTA在不同时间点(4h、8h、12h、24h)刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7。采用Western Blot方法检测TLR2信号和Mer TK信号相关蛋白分子的表达水平。2.Gas6中和抗体对LTA诱导Mer TK活化的影响首先,使用特异性Mer抑制抗体预处理RAW264.7巨噬细胞1h后,分别用200 ng/ml LTA刺激RAW264.7细胞12h及400 ng/ml Gas6刺激RAW264.7细胞10 min。其次,使用Gas6中和抗体预处理RAW264.7巨噬细胞1h后,用200 ng/ml LTA刺激RAW264.7细胞12h。最后都通过Western Blot方法检测Mer TK活化情况。3.采用免疫细胞化学和Western Blot方法检测靶向干预Mer TK后Mer TK and P-Mer TK的表达使用特异性Mer抑制抗体或Ig G预处理RAW264.7巨噬细胞1h,再用200 ng/ml LTA刺激RAW264.7细胞12h,然后分别采用免疫细胞化学和Western Blot方法检测Mer TK and P-Mer TK的表达水平。4.靶向干预Mer TK对LTA诱导炎症反应及TLR2和Mer TK信号下游相关蛋白表达的影响首先,使用特异性Mer抑制抗体或Ig G预处理RAW264.7巨噬细胞1h,再用200ng/ml LTA刺激RAW264.7细胞48h,然后采用ELISA方法检测培养上清中促炎症因子TNF-αand IL-6的表达水平。其次,使用特异性Mer抑制抗体预处理RAW264.7巨噬细胞1h,再用200 ng/ml LTA刺激RAW264.7细胞12h,然后采用Western Blot方法检测TLR2信号和Mer TK信号下游相关蛋白分子的表达水平变化。5.靶向抑制PI3K对LTA诱导炎症反应及TLR2信号下游相关蛋白表达的影响首先,使用PI3K特异性抑制剂LY294002预处理RAW264.7巨噬细胞1h,再用200ng/ml LTA刺激RAW264.7细胞48h,然后采用ELISA方法检测培养上清中促炎症因子TNF-αand IL-6的表达水平。其次,使用PI3K特异性抑制剂LY294002预处理RAW264.7巨噬细胞1h,再用200 ng/ml LTA刺激RAW264.7细胞12h,然后采用Western Blot方法检测TLR2信号下游相关蛋白分子的表达水平变化。研究结果1.LTA刺激巨噬细胞能够活化TLR2信号通路和Mer TK信号通路RAW264.7细胞在LTA刺激作用下,TLR2信号通路下游相关蛋白分子My D88、IκB-α、p65及ERK被活化;此外,Mer TK信号通路下游相关蛋白分子Akt和SOCS3也被活化。而且,除了ERK之外它们的活化是呈现时间依赖性方式。2.LTA诱导Mer TK活化是Gas6依赖性的首先,使用特异性Mer抑制抗体预处理能显著降低LTA以及Gas6刺激RAW264.7细胞诱导的Mer TK磷酸化水平。其次,使用Gas6中和抗体预处理能明显抑制LTA诱导的Mer TK的活化。3.Mer TK负性调控LTA诱导的炎症反应使用特异性Mer抑制抗体预处理能明显增加LTA刺激RAW264.7细胞诱导促炎症因子TNF-α和IL-6的水平。而且,使用特异性Mer抑制抗体预处理能明显增强NF-κB的活化(P-IκB-α、P-p65表达水平明显升高)。4.Mer TK通过PI3K/Akt信号通路和SOCS3蛋白参与LTA诱导炎症反应的负调控RAW264.7细胞在LTA刺激作用下,Akt和SOCS3活化是Mer TK依赖性的。同时,使用特异性Mer抑制抗体预处理能明显阻止LTA诱导的Akt和SOCS3活化;而且PI3K/Akt通路和SOCS3蛋白抑制TLR2介导的炎症反应。研究结论1.LTA刺激巨噬细胞诱导了TLR2促炎信号和Mer TK抗炎信号通路的活化。2.Mer TK通过PI3K/Akt通路和SOCS3蛋白来负性调控LTA所诱导的炎症反应。二.Mer TK在巨噬细胞吞噬金葡菌中的作用研究研究背景目前,研究证明表达于巨噬细胞表面的许多受体同时参与凋亡细胞和细菌的识别与吞噬,包括SR-A、CD14、整合素、补体受体和Fc受体等。此外,表达于巨噬细胞表面的Mer TK对于凋亡细胞的迅速吞噬是必不可少的。因此,本研究我们探讨Mer TK受体是否也参与对细菌的吞噬。研究目的1.金葡菌刺激RAW264.7巨噬细胞,检测吞噬信号相关蛋白的表达。2.研究Mer TK在RAW264.7巨噬细胞吞噬金葡菌中的作用。研究方法1.Western Blot检测金葡菌刺激巨噬细胞中相关蛋白的表达用金葡菌在不同时间(20min、40min、60min、120min)刺激RAW264.7巨噬细胞。然后,采用Western Blot方法检测在金葡菌刺激RAW264.7巨噬细胞过程中相关蛋白分子的表达水平。2.分别从蛋白分子水平和形态学方面研究Mer TK对巨噬细胞吞噬金葡菌的影响我们从蛋白分子水平检测Mer TK对RAW264.7巨噬细胞吞噬相关蛋白分子的影响。使用特异性Mer抑制抗体预处理RAW264.7巨噬细胞1h,再用金葡菌刺激RAW264.7细胞1h后。首先,通过Western Blot方法检测吞噬相关蛋白P-FAK及GTP-Rac1的表达水平。其次,通过吞噬试验对RAW264.7细胞的吞噬金葡菌的能力进行评估。研究结果1.金葡菌刺激RAW264.7细胞能够引起其表面多种受体分子的活化金葡菌刺激RAW264.7细胞能够引起其表面多种受体分子的活化,包括TLR2信号通路(My D88、p65、JNK、ERK、p38)、SR-A及Mer TK,并且它们的活化呈时间依赖性方式。2.金葡菌刺激RAW264.7细胞能够诱导吞噬相关蛋白FAK及Rac1的活化同时,金葡菌刺激RAW264.7细胞能够引起FAK磷酸化水平明显的增加以及体现Rac1活化的GTP-Rac1表达水平的增高,并且也呈时间依赖性方式。3.靶向干预Mer TK对金葡菌诱导FAK及Rac1的活化无明显影响使用特异性Mer抑制抗体预处理RAW264.7巨噬细胞1h,再用金葡菌刺激RAW264.7细胞1h,之后我们从蛋白分子水平检测了这种特异性Mer抑制抗体对吞噬信号通路相关蛋白P-FAK及GTP-Rac1的影响。我们发现,这种抗体对金葡菌刺激RAW264.7细胞活化的P-FAK和GTP-Rac1的表达水平无明显影响。4.Mer TK对巨噬细胞吞噬金葡菌的能力无显著影响为了进一步证实Mer TK在巨噬细胞吞噬金葡菌中的作用,我们通过吞噬试验对RAW264.7巨噬细胞的吞噬金葡菌的能力进行评估。我们发现,给予特异性Mer抑制抗体预处理后,RAW264.7细胞吞噬金葡菌的能力无显著性变化。研究结论1.金葡菌刺激巨噬细胞诱导吞噬信号及Mer TK的活化。2.然而,Mer TK对巨噬细胞吞噬金葡菌不是重要的。