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[背景及目的]糖尿病足溃疡是糖尿病最严重的并发症之一,约有14%～24%的患者面临截肢。大量研究显示,创面微环境平衡紊乱致局部血管生成障碍是糖尿病足溃疡迁延不愈的重要原因。因此,采用促血管新生的办法,提高局部微循环灌注,改善创面微环境,可显著促进其愈合效率。近年来通过基因技术将具有促进血管新生作用的血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)基因导入质粒或病毒载体中,使其在病灶局部持续高表达VEGF,进而促进血管形成以及创面愈合。目前,这种治疗现已广泛应用于下肢和心肌缺血性疾病的实验研究,显示了VEGF基因在促血管新生及改善缺血组织血流量方面的优势。国外也有将携带VEGF165基因的腺病毒载体运用于糖尿病大鼠皮肤创面的研究,结果显示,其在明显促进血管生成的同时,显著缩短了创面愈合的时间。但目前尚缺乏VEGF165基因联合干细胞治疗应用于糖尿病足溃疡的实验报道。本实验拟构建携带hVEGF165基因的腺病毒表达载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs),体外检测其转染效率、增殖能力、蛋白及基因表达水平,并移植到糖尿病大鼠足溃疡,观察移植后细胞的存活情况,及其在血管生长及创面愈合方面的作用。[方法]1.构建携带hVEGF165基因的腺病毒表达载体(pAdxsi-EGFP-hVEGF165):用双酶切法将pGH-VEGF165质粒中的hVEGF165cDNA克隆到穿梭载体pShuttle-CMV-EGFP上,并转移至pAdxsi载体获得pAdxsi-EGFP-hVEGF165病毒质粒。基因测序及酶切鉴定正确后,转染HEK293细胞,收获重组腺病毒,TCID50法测定病毒滴度。2.hVEGF165基因体外转染大鼠BMSCs:贴壁法培养Wistar大鼠BMSCs,已构建的携带增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的重组腺病毒(pAdxsi-EGFP)以不同感染复数(MOI)转染第3代BMSCs,荧光强度观察及流式细胞鉴定方法确定最适MOI值；已构建的携带hVEGF165基因的重组腺病毒(pAdxsi-EGFP-hVEGF165)以最适MOI值转染BMSCs,Western blot、RT-PCR及ELISA法检测转染后hVEGF165的表达。MTT法评价转染后BMSCs生长增殖情况。3.转染hVEGF165基因的BMSCs移植于糖尿病大鼠足溃疡的实验研究：120只SPF级Wistar大鼠糖尿病足溃疡造模成功后,于创面局部实施细胞移植。实验动物分组：A组：正常溃疡对照组(注射PBS),B组：糖尿病溃疡对照组(注射PBS),C组：基因治疗组(注射Ad-VEGF165)、D组：干细胞治疗组(注射BMSCs)、E组：基因转染干细胞治疗组(注射BMSCs/Ad-VEGF165),每组24只。移植后观察EGFP标记的移植细胞在创面局部的存活情况,各组大鼠创面愈合效率,抗CD34免疫组化染色评价创面血管再生情况,Western blot及q-PCR法检测移植后局部VEGF的表达情况。[结果]1.酶切鉴定及基因测序提示重组腺病毒质粒含有hVEGF165cDNA;经多轮感染、扩增后,病毒滴度可达1×1010pfu/mL。2.腺病毒对BMSCs具有较高的转染效率,荧光倒置相差显微镜观察转染pAdxsi-EGFP后MOI为150pfu/cell时转染效果最佳,流式细胞仪检测转染效率约88%。Western blot和RT-PCR检测示,pAdxsi-EGFP-hVEGF165转染BMSCs48h后在蛋白和基因水平上均可有效表达hVEGF165; ELISA检测示其含量在7d达高峰,在20d时仍有表达,1、3、5、7、9、11、13、15、20d各时间点hVEGF165含量均显著高于EGFP基因转染组及未转染组(P<0.05)。MTT结果显示,各时间点转染pAdxsi-EGFP-hVEGF165的BMSCs与未转染组细胞的吸光度(A)值比较差异无统计学意义(P>0.05)。3.建立的糖尿病大鼠足溃疡模型简便可靠。BMSCs局部移植后24h及7d,均可见到EGFP标记的BMSCs。细胞移植后1、3、7、14d,E组分别与B组、C组、D组比较,创面愈合率、VEGF基因及蛋白表达水平、局部毛细血管数量均有显著改善(P<0.05)；但仍与A组有一定差异(P<0.05)。[结论]1.构建了较高滴度的重组腺病毒pAdxsi-EGFP-hVEGF165。2. BMSCs是一种较理想的基因载体细胞,腺病毒对BMSCs具有较高的转染效率,转染后目的基因表达水平较高、持续时间较长。3.通过比对各种治疗方法干预后,局部内源性VEGF164的变化、新生血管的数量、创面愈合效率及病理学变化,在充分证实VEGF促血管新生对于提高创面愈合效率可行性的基础上,也肯定了基因转染BMSCs在维持局部外源性基因长期有效表达的前提下,充分发挥了促血管新生作用,从而在溃疡愈合效率及微观病理学变化均显著优于单独基因治疗及单独细胞治疗。