癌症是目前威胁人类健康的主要疾病之一,也是当今世界的一大难题之一,是常见病,多发病,同时也是世界上死亡率最高的疾病之一。据美国国立癌症研究所的数据显示,2014年美国将会有1665540例癌症新发病例,并且将会有585720人死于癌症。结直肠癌是发生于结直肠部位的胃肠道常见的恶性肿瘤之一,发病率很高。在一项研究中我们发现,在所有研究的国家中,日本结直肠癌的发生率近年来有所下降,其它国家的发生率没有上升,然而结直肠癌的发生率却很高,中国结直肠癌的发生率更是有所升高。据上海市的统计数据显示,结直肠癌的发病率呈现逐年上升的趋势,并已超越胃癌位居恶性肿瘤中的第二位,仅次于肺癌。对结直肠癌患者来说,在初诊时,就有25%的患者被发现有肝转移,总的病程中,50%的病人会发生肝转移,在所有死于进展期结直肠癌的患者中,约60-70%的患者伴有肝转移。肿瘤细胞的转移是其恶性化的特征和标志,同时也是绝大多数的癌症患者治疗失败和死亡的主要原因。因此,癌症转移的分子机制对于癌症的基础研究具有非常重要的理论价值和实践意义。癌症的转移是一个复杂、多步骤、多阶段的病理过程,必须成功地完成所有的步骤才能完成肿瘤的转移。当一个原发的肿瘤开始生长时,它需要形成一个供血系统,以供自身代谢所需。这些新生的血管同时也提供了一个供细胞逃生的途径,癌细胞可以迁移到邻近的组织中,脱离原发肿瘤,并穿过基底膜进入血管,通过这一途径癌细胞可以进入身体的血液循环系统。癌细胞也可以从淋巴系统直接进入到血液循环系统中。癌细胞需要在循环过程中存活,直到外渗到周边组织或器官中。一旦到达一个新的位点,细胞就开始并且继续生长形成微转移灶,并且通过新生的血管来维持自身生长,以形成肉眼可见的肿瘤,这整个过程被称为肿瘤的转移。癌细胞在转移的这一过程中,会遇到一系列的屏障,单靠自身的运动能力是无法克服这些屏障的,必须在某些降解基质和基底膜成分的酶的共同作用下,才能完成。其中癌症开始转移的重要途径是细胞外基质和基底膜的降解。相关研究指出,癌细胞转移过程中细胞外基质和基底膜重塑是重要环节,而这一环节需要借助蛋白降解酶的表达和激活。基质金属蛋白酶(Matrix metallopromteinase, MMPs)是一类锌离子依赖性蛋白酶,几乎能降解细胞外基质中的各种蛋白成分,破坏癌细胞转移的组织学屏障,在肿瘤转移中起关键性的作用,被认为是该过程中主要的蛋白水解酶。MMPs家族现在已经分离鉴别出编号分别为MMP1-26的26个基质金属蛋白酶。由于它们片段同源性的特点,以及作用底物的不同,MMPs被分为基质溶解素、furin活化的MMP、胶原酶、基质降解素、明胶酶以及其他分泌型MMP这6个不同的种类。IV型胶原酶是其中重要的一类,它主要有两种形式,一种是被糖化,分子量为92kD,命名为基质金属蛋白酶-9(MMP-9)；另一种是非糖化,分子量为72kD,被称为基质金属蛋白酶-2(MMP-2)。目前对MMP-2, MMP-9的研究比较深入。MMP-9在人体的正常生理过程中起着非常重要的作用,如：胚胎发育,再生,组织塑性等,同时它在癌细胞的转移中也起着非常关键的作用。MMP-9是细胞以无活性的酶原形式被分泌,激活后,降解细胞外基质中的胶原纤维,它的活化意味着启动了癌细胞的转移。研究显示,MMP-2在癌细胞向周边组织迁移的过程中,在胞外溶解基质,为细胞迁移开辟道路的过程中也发挥了重要的作用。硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)是近年来越来越被人关注的新型气体信号分子,其生物学功能类似于一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO),被认为是继NO和CO之后的第三种气体信号分子,已有大量的实验证实其在神经、心血管、消化、呼吸、内分泌、免疫及泌尿等系统中调节组织功能及代谢过程。在哺乳动物体内,H2S主要由以下三种酶催化产生,胱硫醚-p-合成酶(cystathionine-β-synthase, CBS)、胱硫醚-丫-裂解酶(cystathionine-y-lyase, CSE)、3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST), CBS和CSE在胞浆内以L-半胱氨酸为底物代谢生成H2S,3-MST在线粒体内以p-巯基丙酮酸为底物生成H2S。三种代谢酶在体内组织器官的分布存在特异性,一般来说,CBS主要存在于中枢神经系统,CSE主要存在于外周器官,而3-MST在红细胞中的活性较强。体外实验,H2S主要由供体提供,如硫氢化钠(NaHS)等。近年来的研究表明,气体信号分子在结肠癌的发生、发展中发挥着重要的作用,如NO与结肠癌的增殖和迁移密切相关,参与了结肠癌的增殖和迁移。CO生成酶血红素氧合酶,其蛋白表达水平在结肠癌组织中高于正常黏膜。研究发现H2S能抑制人呼吸道平滑肌细胞的增殖,促进中性粒细胞的迁移,对不同癌细胞的生长起着不同的作用,但由于其为含硫氨基酸代谢产物,其作用特点可能有别于NO和CO。国内外硫化氢和结肠癌细胞迁移之间的关系目前未见研究报道,因此,H2S能否诱导结肠癌细胞的增殖与迁移,是否与结肠癌发生、发展相关值得关注。乙酰化和去乙酰化是机体调控多种生理病理过程的一种重要途径,而去乙酰化的实现有赖于去乙酰化酶的催化。沉默信息调节因子1(silent information regulator1, SIRT1)是哺乳动物体内的sirtuins家族成员之一,是一种依赖烟碱腺嘌呤二核苷酸的去乙酰化酶,通过去乙酰化组蛋白和众多的非组蛋白(STAT3. p53、FOXO家族),参与调控细胞的增殖、凋亡、衰老、能量代谢和细胞迁移等。已有文献报道SIRT1在乳腺癌、前列腺癌中表达异常,提示SIRTl可能在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。目前SIRT1在结肠癌发生发展中的作用和机制还知之甚少。根据以上理论,本研究拟通过培养结肠癌SW480细胞系,通过外源性提供H2S,应用MTT实验、细胞划痕实验、Western-blot实验来观察H2S与结肠癌增殖与迁移之间的关系,并探讨其可能的机制。为结肠癌转移机制的探索和临床治疗靶点的寻找提供理论依据。为此本课题进行了如下研究：方法：1.MTT实验观察硫化氢与结肠癌SW480细胞增殖之间的关系0.25%胰蛋白酶消化SW480细胞,用含5%胎牛血清的DMEM培养基稀释后以1×104个/L的密度接种于96孔板中,每孔200μL,正常培养24h后,使细胞贴壁。每组各加入NaHS,使NaHS终浓度依次为：50μmol/1(1组)、100μmol/1(2组)、200μmol/1(3组)、400μmol/1(4组),共设4个浓度,每组6个复孔,并设对照组(含5%胎牛血清的培养基及细胞)及空白孔(5%胎牛血清培养基)。培养24,48,72h后,吸出培养液,加入pH7.2-7.4磷酸盐缓冲溶液(PBS)100μL/孔,清洗2遍,吸出PBS液,并于每孔加入MTT(5g/L)20μL。继续再培养4h后,吸弃培养液,每孔中各加入二甲基亚砜(DMSO)150μL,放于摇床上避光低速振荡10分钟,使结晶物充分溶解,然后用酶联免疫检测仪在570nm的波长处检测光密度值(OD值),进行3次独立实验。2.细胞划痕实验观察硫化氢与结肠癌SW480细胞迁移之间的关系将SW480细胞接种到6孔板,待90%融合后,行同步化处理4h,然后用黄色无菌枪头在培养板的单层细胞相同位置划直线,造成“伤口”,用PBS洗去脱落的细胞,再加入1%DMEM培养基和处理因素共同孵育24h,显微镜下观察SW480细胞从划痕处向中央处爬行的距离,其距离的大小表示SW480细胞迁移能力的强弱,随机选取5个视野进行观察并拍摄,最后应用图像分析软件Image-J测量计算细胞迁移的距离,计算平均值,进行3次独立实验。3. Western-blot实验观察硫化氢对结肠癌SW480细胞MMP-9、MMP-2、SIRT1表达情况的影响将SW480细胞进行预处理后,用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液于冰上进行裂解30分钟,然后用细胞刮刀刮取细胞,在高速离心机上4度12000rpm/min离心5分钟,然后取上清,用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。以适当的比例与上样缓冲液混合均匀,100度煮沸10分钟后上样,行6-12%SDS-PAGE电泳,转膜(转到PVDF膜上)、用5%脱脂奶粉进行室温封闭1小时,然后将PVDF膜与一抗(MMP-21:1000, MMP-91:1000, SIRT11:2000, β-actin1:4000)4度孵育过夜,TBST漂洗三次,每次10分钟后,用羊抗兔IgG或羊抗小鼠IgG分别室温孵育1h, TBST漂洗同前,加入ECL试剂后,再显影、定影、拍照,用Image-J软件对条带的灰度进行分析。每个实验重复三次。结果：1.H2S促进结肠癌SW480细胞的增殖用MTT法检测,SW480细胞用不同浓度的NaHS(0,50,100,200和400μmol/l)分别处理24,48,72小时,结果24h后,50,100,200和400μmol/l的处理组其OD值均高于对照组(P<0.05,0.01,0.05,0.01),48h和72h后,各组的OD值都高于相应时间组的对照组(48h:P<0.01,0.01,0.001,0.001;72h: P<0.01,0.001,0.05,0.05),差异具有统计学意义,NaHS处理后,能够显著促进SW480细胞的增殖。2.H2S增强结肠癌SW480细胞的迁移采用细胞划痕实验检测H2S对SW480细胞迁移的影响,结果,100μmol/l NaHS处理24小时后,对照组的迁移率是23.8%,处理组的迁移率是40.5%,处理组结肠癌SW480细胞的迁移能力明显增强(P<0.01),H2S能够促进SW480细胞的迁移。3.H2S增强MMP-2、MMP-9和SIRT1表达Western-blot实验检测MMP-2、MMP-9和SIRT1的表达情况。结果,100μmol/l的NaHS处理结肠癌SW480细胞24小时后,MMP-2的表达水平与对照组相比增加了11.4%(P<0.05),MMP-9的表达水平与对照组相比增加了18.2%(P<0.01).和正常对照组相比,100μmol/l的NaHS处理结肠癌SW480细胞24小时后,SIRT1的表达水平显著上调,差异有统计学意义(P<0.05)。H2S能增强SW480细胞MMP-2、MMP-9和SIRT1的表达。结论：硫化氢能促进结肠癌SW480细胞的增殖,并通过上调MMP-2、MMP-9促进结肠癌SW480细胞的迁移,这一过程可能与上调SIRT1的表达有关。