Hippo Pathway是一类重要的调节器官生长的信号通路。在Hippo信号通路中，其核心就是由一系列的磷酸化的成分组成：丝氨酸/苏氨酸Ste20家族激酶Hpo;核Dbf-2相关（NDR）家族激酶Warts(Wts),以及两种相互作用的支架蛋白Sav和作为肿瘤抑制基因(Mats)的Mob。当其中任何一个成员发生突变时，都会造成细胞的生长异常。例如：在成虫的发育过程中，Wts的突变在多个器官和组织的发育过程中能够引起剧烈的细胞增殖。Yorkie，作为存在于在Hippo Pathway信号通路中最核心的含有WW结构域的转录共激活因子，是该信号通路中一个激酶级联反应最重要的下游元件，即Hop-Sav复合物磷酸化并激活Wts-Mats复合物的下游元件。激活后的Wts-Mats复合物导致转录辅助激活因子Yorkie(Yki)发生磷酸化与细胞质中的14-3-3蛋白结合，从而失活并滞留在细胞质中。当Hippo Pathway信号通路发生抑制时，Yki的抑制作用就会消失，进入细胞核中，与转录因子Sd结合,通过调节Hippo Pathway的目的基因包括diap1，cyclinE和Bantam来引起细胞的增殖以及抑制细胞凋亡等过程。　　1.家蚕Yki基因不同剪接体及突变体转化细胞的筛选与鉴定　　为了研究家蚕Hippo信号通路中的关键辅助转录因子BmYki不同剪接体的功能，需要获得稳定的转基因细胞系。通过获得重组质粒pIZT-V5/His-BmYki2和pIZT-V5/His-BmYki3，将获得的重组质粒和钱莹先前构建好的pIZT-V5/His-BmYki1和pIZT-V5/His-BmYki1S97A以及本实验室保存好的空载pIZT-V5/His载体转染进家蚕BmN细胞中。细胞定位结果显示：BmYki1，BmYki2，BmYki3及和BmYki1S97A蛋白在家蚕BmN培养细胞中能够表达，且BmYki1主要分布在细胞质中，BmYki2主要分布于细胞核中，BmYki3主要分布于细胞核中，磷酸化位点突变后的BmYki1S97A在细胞核中也能检测到，表明BmYki1磷酸化对于该蛋白的表达位置起着重要作用，空白对照组显示Yki基因主要分布于细胞质中。从而进一步说明在Hippo信号通路中，BmYki2和BmYki3对细胞的生长起着正调控的作用。　　2.过表达BmYki1，BmYki2，BmYki3及BmYki1S97A对细胞及家蚕翅原基的影响　　为了探讨BmYki基因不同剪接亚型的功能，本章研究主要在两方面进行：细胞和翅原基。　　当不同剪接亚型基因在细胞上过表达时，细胞迁移、细胞增殖、细胞大小和细胞周期均发生了不同的变化。结果显示：在0 h-78 h，过表达BmYki1，BmYki2，BmYki3，BmYki1S97A及pIZT-V5/His载体的BmN细胞及野生型细胞分别迁移了1294.96μm，1097.62μm，1327.60μm，1098.87μm，633.59μm，1027.00μm，而其中过表达BmYki3的细胞相比较野生型细胞及其他转基因细胞而言在相同的时间内迁移距离最大。pIZT-V5/His-BmYki1-BmN细胞和pIZT-V5/His-BmYki3-BmN细胞分裂速度高于野生型BmN细胞；pIZT-V5/His-BmYki2-BmN细胞，pIZT-V5/His-BmYki1S97A-BmN细胞和pIZT-V5/His-BmN细胞分裂速度低于野生型BmN细胞。其中p IZT-V5/His-BmYki3-BmN细胞分裂速度最高，pIZT-V5/His-BmYki1S97A-BmN细胞分裂速度最慢。细胞大小随着时间的增长在逐步增加，BmN细胞，pIZT-V5/His-Bm Yki1-BmN细胞，pIZT-V5/His-BmYki2-BmN细胞，pIZT-V5/His-BmYki3-BmN细胞分别在第3天，第3、5天，第3、6天，第2、5天时，细胞又突然变小，可能由于细胞开始新一轮的增殖分化。在细胞周期方面，pIZT-V5/His-BmYki1-BmN细胞、pIZT-V5/His-BmYki2-BmN细胞、pIZT-V5/His-BmYki3-BmN细胞的S期/G2期普遍比对照组细胞高，而突变体转基因细胞的S期/G2期和对照组细胞相近。过表达B mYki1基因后，kibra、iap、fj和ex基因的表达量较pIZT-BmN细胞有显著增加；过表达BmYki2基因后，wnt、kibra、iap、fj、ex和bmpr基因较pIZT-BmN细胞有显著增加；过表达BmYki3基因后，wnt、kibra、iap、fj、ex和bmpr基因均有显著上调；过表达BmYki1S97A基因后，wnt、kibra、fj、ex、crb和bmpr基因表达量较p IZT-BmN细胞有所提高。cat、dpp、serr和stat基因在pIZT-V5/His-BmN、转Bm Yki1，BmYki2，BmYki3和BmYki1S97A的细胞系中的表达水平均下调。　　在翅膀过表达后，过表达BmYki1基因，BmYki2基因和BmYki3基因时，蚕蛾右翅发育异常的比例分别有30％、40%和30%；而只注射ddH2O的对照组的蚕蛾翅膀均正常发育。前翅扩大比率普遍比后翅扩大比率大。当翅膀过表达BmYki1时，myc、ex、kibra、wts2、iap、fj、bmpr、wnt和dpp基因均有所下降，cat、cycE和stat基因上调；当过表达BmYki2时，myc、ex、kibra、wts2、iap、fj、bmpr、wnt和dpp基因均有所下降，cat和cycE基因上调；当过表达BmYki3时，myc、ex、kibra、fj和dpp基因均有所下降，cat、cycE、crb和wts2基因上调。　　3.过表达BmYki3家蚕细胞转录组的比较研究　　为了更加全面了解过表达BmYki3后，家蚕BmN细胞内部基因发生的变化，通过应用RNA-Seq技术获得转录组信息。分析结果显示：，在家蚕BmN细胞与过表达BmYki3细胞比较中，其中上调基因的数量有10291个，下调基因的数量有4444个。GO(Ontology)富集分析显示：差异表达基因有49个GO分类，分别在细胞组件、分子功能和生物进程三个大类中。KEGG富集分析显示，与家蚕细胞增殖、分化、凋亡、大小相关的MAPK、Wnt、Hippo、JAK-STAT、mTOR等信号通路均有富集，且有基因富集多个信号通路中，将多条信号通路联系在一起，共同发挥调控作用。　　在家蚕Hippo信号通路中，剪接体BmYki1、BmYki2和BmYki3功能有所不同，其中BmYki1起次要的正调控作用，BmYki2起微调及平衡调节作用，BmYki3起着主要正调控作用。当过表达BmYki1时，会促进BmYki3的表达，主要定位于细胞质中，细胞增殖速度变快，细胞分裂数增加，细胞迁移速率变快，细胞体积增大；当过表达BmYki2时，并不会促进BmYki3的表达，反而使BmYki3的表达量有微弱下调，由于缺少一个WW结构域，主要定位在细胞核中，细胞质中也存在，细胞的增殖速度没有明显变快，细胞分裂数没有明显增加，细胞迁移速率么有明显加快；当过表达BmYki3时，会促进BmYki1的表达，但是BmYki3的表达量没有明显增加，由于在在第5个外显子3‘端和第6个外显子5’端分别增加了15个和5个碱基，主要定位在细胞核中，细胞质中也存在，细胞增殖速度最快，细胞分裂数增加最多，细胞迁移速率最快，细胞体积增大。