胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是恶性程度高的胶质瘤,拥有很强的增殖、迁移和侵袭能力。约占全部颅内肿瘤的12~15%,由于肿瘤与正常的脑组织之间没有特别明显的边界,手术方法也不能将其完全切除,又因其发生于颅腔中,常规的放疗和化疗对残留的肿瘤细胞杀伤能力有限,所以胶质母细胞瘤病人的生存状况一直得不到很好的改善,患者的平均寿命仅为15个月左右,只有5%的患者寿命能够延续5年以上,多数患者仍然死于胶质母细胞瘤的复发。因此深入了解胶质母细胞瘤发病及恶化的分子机制,推动其预防和治疗手段的发展迫在眉睫。转录因子HOXC9(Homeobox C9)是同源异形框(Homeobox,HOX)家族的成员之一,主要在胚胎发育及成体细胞分化过程中提供前后轴定位信息的作用。近年来有报道显示HOXC9基因的表达异常可能与一些肿瘤的形成有关,因此阐明其与肿瘤之间的关系可能为肿瘤的治疗提供新的思路。而HOXC9基因与胶质母细胞瘤的发生发展是否相关目前还没有相关的报道。本项目就此展开研究探讨HOXC9对胶质母细胞瘤病人预后的影响,及其对胶质母细胞瘤增殖、成瘤、迁移、侵袭能力的影响,并对HOXC9调控胶质母细胞瘤细胞自噬的机制进行了深入的研究,为胶质母细胞瘤的治疗提供新的生物学理论和分子基础。本研究目前取得的研究成果如下:(1)HOXC9对胶质母细胞瘤预后的影响及其表达分析为了研究HOXC9在胶质母细胞瘤中担任什么角色,它的表达量是否与胶质母细胞瘤病人的预后相关,我们首先通过利用R2:Genomics Analysis and Visualization Platform平台上的两个数据库对胶质瘤病人预后和HOXC9表达量之间的关系进行分析。结果表明,HOXC9的表达量与胶质瘤病人的预后密切相关。HOXC9表达量高,病人预后差,生存率低;HOXC9表达量低,病人预后好,生存率高。由此可见,HOXC9的表达量与胶质瘤病人的预后密切相关。胶质瘤的预后与其临床分级有关,分级越高,患者的预后越差。我们通过数据库提供的数据对不同分级胶质瘤中HOXC9的表达量进行分析,我们发现,胶质瘤中HOXC9的表达量要高于正常胶质细胞,这暗示着HOXC9可能参与胶质瘤的发生过程。此外,并且随着胶质瘤分级的提高,HOXC9的表达量也随之提高,二者存在正相关,这暗示着HOXC9可能参与胶质瘤的发展过程。我们还发现,在不同分级胶质瘤中HOXC9的表达量也与病人的预后密切相关。HOXC9表达量高,病人预后差,生存率低;HOXC9表达量低,病人预后好,生存率高。随后,我们用免疫印迹四个胶质母细胞瘤细胞系中HOXC9蛋白的表达量做了检测。检测结果发现,HOXC9在四个胶质母细胞瘤细胞系中普遍表达。A172的恶性程度在四个细胞系中相对较低,没有成瘤能力,而它的HOXC9蛋白的表达量在四个细胞系中也相对较低,这暗示着HOXC9的表达量与胶质母细胞瘤的恶性程度可能存在一定的相关性。此外,我们通过免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)和免疫印迹(Western Blot)检测胶质母细胞瘤临床样本及其癌旁组织中HOXC9的表达量。从结果我们可以看到,胶质母细胞瘤样本中HOXC9的表达水平要明显高于其癌旁组织,这说明HOXC9可能参与胶质母细胞瘤的发生过程。(2)HOXC9对胶质母细胞瘤增殖、迁移侵袭能力的影响为了研究下调HOXC9对胶质母细胞瘤增殖能力的影响,我们利用慢病毒介导的RNAi技术在三个胶质母细胞瘤细胞系里干扰HOXC9基因的表达。在下调HOXC9表达之后,我们从显微镜观察到三个胶质母细胞瘤细胞系实验组的细胞数目要明显少于对照组,我们通过血球计数板分别对两组细胞的数量进行计数,统计结果也与上述类似。这暗示着下调HOXC9会影响胶质母细胞瘤细胞的增殖能力。此外,我们用MTT法和Brd U法比较对照组与实验组的细胞增殖能力。MTT法检测显示三个胶质母细胞瘤细胞系的细胞的增殖能力都在下调HOXC9之后发生了明显的下降。免疫荧光检测及阳性信号统计显示实验组Brd U阳性细胞数目要明少于对照组,这说明实验组在进行DNA复制的细胞减少,这也从另一个角度说明实验组细胞增殖能力减弱。为了研究下调HOXC9对胶质母细胞瘤细胞迁移及侵袭能力有没有影响,我们首先进行了细胞划痕实验。从两个细胞系的实验结果我们可以看出,HOXC9干扰组胶质母细胞瘤细胞的划痕愈合能力要明显弱于对照组,这说明HOXC9干扰组细胞的迁移能力被削弱。随后,我们又进行了Transwell实验。实验结果表明,两个胶质母细胞瘤细胞系HOXC9下调组在相同时间内穿膜的细胞数要明显少于对照组。这再次说明HOXC9在胶质母细胞瘤细胞迁移能力中发挥重要作用。为了检测细胞的侵袭能力是否受到影响,我们进行了基质胶(Matrigel)Transwell实验。实验结果显示,两个胶质母细胞瘤细胞系下调HOXC9组穿过含有基质胶的Transwell小室的能力要明显比对照组弱。这说明胶质母细胞瘤细胞的侵袭能力在下调HOXC9之后受到了抑制。(3)HOXC9对胶质母细胞瘤自噬的影响及其调控机制通过流式细胞仪和Western Blot方法检测我们发现,三个胶质母细胞瘤细胞系在干扰HOXC9之后并没有发生明显的凋亡现象。通过瞬时转染,我们向细胞导入一个可以表达带绿色荧光标签GFP的LC3B蛋白的载体。从对三个胶质母细胞瘤细胞系的实验中我们都观察到,sh HOXC9组细胞在发生自噬;而Control组细胞没有发生自噬。通过细胞免疫荧光实验和Western Blot检测我们发现,下调HOXC9之后胶质母细胞瘤细胞的自噬增强了。为了研究为何在胶质母细胞瘤中下调HOXC9会引发细胞自噬,我们通过查阅相关文献,筛选出8个候选可能参与调控自噬的基因。通过实时荧光定量PCR检测我们发现,在下调HOXC9之后,DAPK1基因的m RNA表达量显著升高。我们把DAPK1作为潜在的重要下游靶标又进一步在三个胶质母细胞瘤细胞系里面检测他的蛋白表达,结果显示,三个细胞系sh HOXC9组DAPK1蛋白的表达水平明显高于Control组。DAPK1只有在其第308位丝氨酸没有被磷酸化时才能够激活细胞自噬,因此,我们通过Western Blot对两个胶质母细胞瘤细胞系的p Ser308-DAPK1进行了检测,检测结果显示,在下调HOXC9之后p Ser308-DAPK1的量并没有增多,而DAPK1的总量发生了明显的上升,这说明308位丝氨酸没有被磷酸化的DAPK1蛋白量相对升高,也就是说能够激活细胞自噬的DAPK1蛋白发生上调,从而增强细胞自噬。我们把皮下成瘤的样本拿来检测得到了类似的结果。接着,我们构建了DAPK1 sh RNA慢病毒载体,在三个胶质母细胞瘤细胞系中下调HOXC9诱导细胞自噬后下调DAPK1基因的表达。通过Western Blot检测我们发现,三个细胞系下调DAPK1组细胞自噬明显减弱。DAPK1诱导细胞自噬需要通过下游因子Beclin1介导,于是为了了解干扰HOXC9诱导的细胞自噬是否是通过DAPK1-Beclin1通路,我们构建了Beclin1 sh RNA慢病毒载体。在两种胶质母细胞瘤细胞系中干扰HOXC9诱导细胞自噬后,下调Beclin1的表达,从实验结果我们观察到,下调Beclin1组比起对照组的自噬要明显减弱。于是我们的实验结果证明干扰HOXC9诱导的细胞自噬主要是通过激活DAPK1-Beclin1这条通路。为了了解HOXC9是如何调控DAPK1基因的表达,我们首先对DAPK1的启动子进行了分析。我们克隆了5个长度不同DAPK1启动子片段并将其插入p GL3-Basic荧光素酶报告载体上,通过双荧光素酶报告系统的检测我们发现,-1121~-368这段序列可能拥有能被某些转录抑制子结合的微点存在。HOXC9通常作为一个转录抑制因子调控基因表达,为了了解HOXC9是否是DAPK1的转录抑制子,我们进行了染色体免疫共沉淀实验。通过Ch IP实验我们检测到HOXC9在DAPK1启动子-528~-412bp处有较高结合。有意思的是P2区域刚好落在-1121~-368之间,这暗示着HOXC9是通过结合到DAPK1启动子-528~-412bp处抑制DAPK1基因的表达。过去曾有报道HOXC9可以特异的识别并结合ATTTAT序列,通过对DAPK1转录起始位点上游-528~-412bp序列进行分析,我们发现了一段ATTTAT序列位于-442~-437之间。以上数据表明,HOXC9是通过结合到DAPK1转录起始位点上游-442~-437序列来抑制DAPK1基因的表达。(4)HOXC9对胶质母细胞瘤细胞成瘤能力的影响为了了解下调HOXC9是否对胶质母细胞瘤的克隆形成能力有影响,我们用两种胶质母细胞瘤细胞系进行了体外的软琼脂克隆形成实验。从实验结果我们观察到,两个胶质母细胞瘤细胞系sh HOXC9组形成的克隆大小比Control组要小,而且形成克隆的数目也比对照组要少。这说明干扰HOXC9的表达影响胶质母细胞瘤的克隆形成能力。为了了解干扰HOXC9是否对胶质母细胞瘤的体内成瘤能力有影响,我们做了小鼠皮下成瘤实验。我们用到两种胶质母细胞瘤细胞系,注射于小鼠背部靠臀侧,左侧臀注射Control细胞,右侧臀注射sh HOXC9细胞。从实验结果我们可以看到,干扰HOXC9的表达可以明显抑制胶质母细胞瘤细胞系的体内成瘤能力。此外,我们还通过NOD/SCID小鼠脑原位注射来测定胶质母细胞瘤细胞体内成瘤能力。从实验结果我们可以看出,sh HOXC9组在小鼠脑中几乎不成瘤,而Control组却形成极大的肿瘤,此外,sh HOXC9组小鼠的存活率要明显高于Control组。以上数据充分说明,干扰HOXC9的表达可强力抑制胶质母细胞瘤的体内成瘤能力。