油茶内生真菌多样性与促生菌株筛选应用研究

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油茶(Camellia oleifera Abel)是我国南方重要的木本油料经济林树种。为提高油茶产量,农民对化肥农药的大量使用,进一步加重土壤养分失调,并对环境造成了极大污染。微生物肥料具有无污染、低投入、高产出等特点,因此,开发利用微生物肥料可为油茶绿色农业可持续发展和贫瘠山地的高效经营提供技术支撑,是生产上急需解决的问题。植物内生真菌种类丰富,普遍存在植物体中,并能通过多种机制促进宿主植物生长。目前关于油茶内生真菌的多样性及对油茶促生菌株筛选应用鲜有报道,有鉴于此,本文拟采用组织分离法分离1a油茶苗和成龄树各个组织器官的内生真菌并筛选优势菌株,利用高通量测序技术分析油茶不同部位内生真菌的群落结构、分布规律和菌种组成的多样性,将通过测定接种优势菌株后油茶苗生长和生理指标分析内生真菌对油茶的促生效果,为挖掘油茶内生真菌资源和开发油茶微生物肥料奠定基础。主要研究结果如下:1、从油茶优良品种“闽43”的1a生根、茎、叶和成龄树根、茎、叶、果实中共分离得到88株内生真菌,鉴定为34个属。其中,1a生油茶根、茎、叶中菌株数量分别是1 1株、13株、10株,成龄树根、茎、叶、果实菌株数分别是9株、22株、10株、13株,从88株内生真菌中筛选出12株优势菌株,分属于葡萄座腔菌属(Botryosphaeria sp.)、土赤壳属(Ilyonectria sp.)、拟茎点霉属(Phomopsis sp.)、刺盘孢属(Colletotrichum sp.)、芒果球座腔菌属(Botryosphaeria sp.)和青霉属(Penicillium sp.)。2、通过对油茶各个样本进行高通量测序,共得到749812条优质序列,测序深度指数高达90%以上,稀释曲线和Shannon-wiener曲线表明测序数据量足够大,对97%相似性水平下的OTU进行聚类分析共产生2364个OTUs,在此基础上对各样本进行Alpha多样性和Beta多样性分析,结果表明,Le1与St1菌落多样性相似,MLe、MSt、Sh和Se四者之间菌落多样性较相似,Le1和St1与MLe、MSt、Sh和Se存在一定的差异,但不显著,Ro1和MRo与其他样本均存在较大差异,但Ro1不表现显著差异,MRo显著高于其他各样,经过物种注释表明油茶具有丰富的内生真菌资源,隶属于8个门3 1个纲1 1 1个目246个科602个属,在属水平上的菌种数量表现为MRo>Le1>St1>MLe>MSt>Ro1>Sh>Se,在各个分类水平对各样进行物种组成分析表明MRo的物种组成与其他各样存在较大差异,1a生根茎叶的优势属分别是Xylogone、拟茎点霉属(Phormopsis)和横断孢属(Strelitziana),成龄树根茎叶中根的优势属是丝盖伞属(Inocybe),茎和叶均是Pseudoidriella,果壳和种子均是枝孢属(Cladosporium)。综上所述,1a生油茶根茎叶中根的物种多样性显著低于茎和叶,茎的物种多样性显著高于叶,物种丰富度叶>茎>根,成龄树根的多样性显著高于茎和叶,而茎和叶二者多样性不存在显著差异,物种丰富度表现根>叶>茎,与1a生根茎叶之间的多样性和物种丰度规律不一致。3、将筛选出的12株优势菌株(编号A-L)通过菌液浇施的方法回接到1a生油茶幼苗,接种90d后测定生长的形态和生理指标,结果表明:1)除B处理外,其他处理的油茶幼苗苗高增长率均高于CK,其中D、L、C处理的苗高增长率显著高于CK(P<0.05),分别是CK的3.57、3.27和2.98倍;对于地径而言,除了 A、B、H处理,其他处理的地径增长率均高于CK,其中,L处理的油茶幼苗地径增长率显著高于CK(P<0.5),是CK的1.79倍;不同菌株处理的新芽数量表明H、D处理的油茶幼苗新芽平均个数明显多于其他菌株处理。2)除C、E处理外,其他处理的油茶幼苗生物量均大于CK,其中,H处理的油茶幼苗生物量显著高于CK(P<0.05),A、D、F、G、H、I、K处理的油茶幼苗根冠比均高于对照组CK,但均未达到显著差异水平(P<0.05)。3)不同菌株回接对油茶幼苗生理指标影响程度不同。C、E、I、K、L处理油茶幼苗叶绿素含量均显著高于CK(P<0.05),其促进效果为I>K>E>C>L;叶绿素荧光参数不同菌株处理间无显著差异;各处理间可溶性糖含量和可溶性蛋白含量存在明显差异,其中L、G处理的可溶性糖含量显著高于CK(P<0.05),D、K处理的可溶性蛋白含量显著高于CK(P<0.05)。综上所述,油茶内生真菌具有丰富的多样性,并且存在着像D、L等菌株对油茶生长发育具有显著促进作用。本研究结果可为油茶生物菌肥开发提供理论依据,对油茶产业具有重要的经济、生态和社会意义。
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