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鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)导致的鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)以侵害三周龄以内的雏鸭为主,是一种急性高度致死性传染病。近年来,由3型鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV-3)引起的DVH广泛流行于中国和韩国,致死率高达80%,严重危害养鸭业的发展。为进一步了解山东省DHAV-3的流行近况、遗传变异规律和分子生物学特征,提高对该病的诊断速度和质量,加强对其的科学防控,本研究进行了以下两部分的研究:第一部分山东地区DHAV-3的病毒分离及分离株P1基因的序列分析2012年7月至2014年7月,对山东省四个地区(济南市、潍坊市、烟台市、临沂市)DHAV-3的流行情况进行了流行病学调查。共采集了18批167份疑似鸭病毒性肝炎致死的鸭肝组织等病料,经病料处理、鸭胚接种和雏鸭人工感染实验对病毒进行分离,用DHAV-3特异性检测引物对分离病毒进行RT-PCR扩增检测,共分离鉴定出70株DHAV-3野毒株。结果表明18批病料中均检出DHAV-3,批次检出率为100%;167份病料中有70份样品为DHAV-3阳性,个体阳性率为41.9%。从此次山东分离株中选取18株DHAV-3代表株,对其P1基因进行克隆测序和序列分析。同源性分析显示,18株DHAV-3分离株P1基因高度保守,其核苷酸和氨基酸序列同源性高达95.9%~99.8%和97.4%~100%。与27株DHAV-3参考株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为91.9%~99.0%和95.2%~99.6%,属同一血清型。进化树分析显示,中国分离株(除B63株)均属于GⅠ型。本研究分离的18株DHAV-3代表株均属于GⅠ型的S1亚型,其中济南、临沂、潍坊三地分离株遗传距离较近,位于同一小分支。越南分离株与中国B63株属于GⅡ型中的S3亚型,而所有韩国分离株组成GⅡ型中的S4亚型。DHAV-3的基因分型呈现明显的地域特征。氨基酸比对结果显示不同分支彼此之间存在多个氨基酸变异位点,其中共有22个氨基酸稳定变异位点。P1基因第671~712位氨基酸处于高变区(HVR),是病毒抗原变异的关键所在。在HVR内,所有的RGD序列变异为QSD序列。第二部分SD1101株单克隆抗体的制备为研制DHAV-3单克隆抗体,用已完成全基因组测序的SD1101株DHAV-3的全病毒免疫适龄BALB/c小鼠,取免疫效果最佳的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,通过间接ELISA法对杂交瘤细胞进行筛选,经三次亚克隆后获得2株稳定分泌针对DHAV-3的单克隆抗体4A2和4C3。对这2株单抗的腹水效价、亚类、染色体数、特异性和稳定性进行了鉴定,结果如下:用间接ELISA检测连续传代和冻存复苏的细胞上清,发现其分泌抗体的能力无显著差异,证明其稳定性好;染色体数目在100左右,呈现典型的杂交瘤细胞染色体特征;经亚类鉴定,2株单抗分泌的抗体类型均为Ig G1亚类、κ亚型;单抗腹水效价为1:10240;IFA结果显示,2株单抗与DHAV-3和DHAV-1均发生特异性反应,但与DHAV-3的反应更强烈。