背景：哺乳动物胚胎发育期间,心外膜细胞能够从上皮细胞转化为间充质细胞(EMT)进而迁移分化为心肌细胞,分布于心脏的各个腔室的心肌组织之中。然而出生后在哺乳动物心肌损伤的情况下,心外膜通过EMT转化的间充质细胞即心外膜来源细胞(EPDCs)能否分化为心肌细胞参与再生却存在较大争议。最近的研究发现,出生7天内的小鼠心肌组织具有一过性的再生能力,心尖切除后能够实现完全再生,这为研究哺乳动物心肌组织再生的细胞来源提供了理想的模型。尽管已有研究指出心肌细胞自我增殖可能是新生小鼠心肌再生的重要方式,但是心肌再生过程中同时发现心外膜上高表达胚胎期的Wilm’s tumor-1(Wtl)基因,Wtl阳性的EPDCs迁徙入心肌层,说明EPDCs可能参与心肌再生。鉴于心外膜细胞在心脏发育和斑马鱼心肌再生中的重要作用,心肌再生过程中心外膜细胞的作用与机制值得探索。明确心外膜细胞在心肌再生过程中的作用对于开发基于原位心肌再生的心肌损伤治疗方案具有重要意义。研究目的：研究新生小鼠心肌损伤后再生的过程中心外膜细胞是否能够通过分化为心肌细胞参与再生；进而探索通过干预维持新生小鼠心外膜上Wtl基因表达是否能够延长心肌再生的时间窗。方法与结果：第一部分：新生小鼠心肌损伤后心外膜细胞分化为心肌细胞参与心肌再生。1)建立新生小鼠心尖切除再生模型,运用Masson和HE染色从形态学上观察到新生小鼠心尖切除后21天,切除的心尖完全再生,用小动物超声评估再生后的小鼠心功能,结果表明与Sham(仅开胸未切除心脏)组小鼠心功能没有明显差异。2)通过Western-Blot、免疫荧光染色、流式细胞技术对心尖切除后心外膜上Wtl基因表达的水平进行检测。结果发现,与Sham组相比,在术后7-14天Wtl蛋白表达水平(Western Blot)及阳性的细胞(免疫荧光和流式细胞计数)均大幅上调,住术后21天时降低至基线水平。并且多数Wtl阳性的细胞都集中在切口附近增厚的心外膜区域,损伤后4-7天增厚的Wtl阳性心外膜细胞包裹心脏缺损区并且呈现向心外膜下层及心肌层迁徙。这一结果提示心尖切除术后会激活心外膜细胞,并且表达胚胎期心外膜祖细胞标志物Wtl,增殖的心外膜细胞向心外膜下层、心肌层迁徙有参与心肌再生的趋势。3)运用免疫荧光技术对Wtl与Snail(上皮细胞向间充质细胞转化的标志物)进行共定位染色。我们发现,在术后2-4天Wtl与Snail双阳细胞达到峰值,提示术后心外膜细胞由上皮细胞向间充质细胞转化(EMT)。免疫荧光技术对Wtl与E-cadherin(上皮细胞间的连接蛋白,EMT时解聚)共染显示表达Wtl的心外膜细胞周围E-cadherin表达明显下降,表明心外膜细胞活化表达胚胎期心外膜细胞标志物Wtl后细胞间的连接蛋白解聚进一步向间充质细胞转化。4)免疫荧光染色P-Smad(胚胎期调控心外膜祖细胞向心肌细胞方向转化的BMP-P-smad信号通路中的调控因子)显示心外膜细胞及心外膜下层细胞核内表达P-smad,表明活化的心外膜细胞在BMP-P-smad信号通路调控下向心肌细胞分化。5)用免疫荧光技术将Wtl分别与心肌祖细胞标志物isll、心肌细胞标志物cTnT、SαA共染,结果表明Wtl与Isll在心外膜、心外膜下及心肌层区域的心肌祖细胞的核内共定位,与cTnT、SαA在未成熟及成熟心肌纤维中共定位。全心消化获取细胞悬液,流式细胞仪分析显示心尖切除术后14天Wtl与cTNT双阳的细胞占全心细胞比例为7.9%,显示Wtl阳性的心外膜细胞转化为间充质细胞后向心肌祖细胞分化并进一步分化为成熟的心肌细胞。如上结果提示,新生小鼠在心尖切除术后,心外膜细胞活化表达胚胎期心外膜祖细胞标志物Wtl,能够经转化为间充质细胞并向心肌层迁移,最终经历心肌祖细胞分化为心肌细胞参与心肌组织的完全再生。第二部分：出生后维持心外膜Wtl基因表达能够延长小鼠心肌再生时间窗。1)胸腺肽beta-4(Tβ4)腹腔注射维持出生后Wtl在心外膜高表达,从小鼠出生当天开始腹腔注射Tβ4(注射剂量为12mg·kg-1,溶剂为PBS),连续注射7天,第7天行心尖切除术,术后隔1日注射1次直至出生后19天；对照组注射PBS。2)Masson和HE染色方法从形态学上观察到Tβ4处理组小鼠心尖切除后21天切除的心尖完全再生,而PBS对照组小鼠心尖切除后21天心尖不能再生,损伤的心肌由疤痕组织替代。超声评估心功能显示术后7,21,60天Tβ4处理组小鼠左室射血分数(EF)与左室短缩分数(FS)明显优于PBS组小鼠,差异具有统计学意义。3)免疫荧光显示心肌损伤后两组小鼠心外膜均增厚并表达胚胎期心外膜祖细胞标志Wtl,但Tβ4处理组小鼠增厚的Wtl心外膜细胞向心外膜下层及心肌层迁徙,而在PBS组未观察到类似迁徙现象；并且在Tβ4组发现Wtl与Isll在心外膜、心外膜下及心肌层细胞的核内共定位,与cTnT、SαA在未成熟及成熟心肌纤维中共定位,在PBS组未观察到此现象。4)免疫荧光共染cTnT和核有丝分裂指标HP3,结果显示Tβ4组和PBS组cTnT/HP3共染的心肌细胞数目均较少,HP3绝大部分表达在心肌间隙细胞及心外膜区细胞。表明Tβ4对于心肌细胞去分化自我增殖没有明显的影响。5)免疫荧光共染血管平滑肌标志物SMA和Wtl,结果显示在Tβ4组和PBS组小鼠心脏损伤区新生血管中均存在SMA和Wtl共染的平滑肌细胞,但Tβ4组心脏损伤区新生血管量明显多于PBS组,表明Wtl标志的EPDCs能分化为血管平滑肌参与损伤区再血管化,而Tp4干预能够促进损伤区血管再生。以上结果显示通过Tβ4维持心外膜细胞出生后Wtl表达使7天小鼠心肌损伤后心外膜细胞能够分化为心肌细胞参与心肌再生,从而延长小鼠出生后心肌再生时间窗。结论：新生小鼠心尖切除后能够激活胚胎期心外膜祖细胞标志Wtl的重新表达,活化的心外膜细胞能够向心外膜下及心肌层迁徙并转化为EPDCs,其能够在BMP-P-smad信号通路调控下向心肌细胞分化。这些结果提示EPDCs是新生小鼠心肌再生重要的心肌细胞来源之一。进一步研究发现,利用Tβ4维持心外膜细胞中Wtl基因的持续表达,能够保留心外膜细胞胚胎期的迁徙分化的特性,并延长了小鼠心肌组织再生能力的时间窗。