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在临床测定中,血清中的肌酐浓度是一项判断肾功能的重要指标。酶法测定肌酐浓度,具有反应专一性强和灵敏度高等特点。本实验室已从土壤中筛选到产肌氨酸氧化酶（SOX）的芽孢杆菌BSD-8（Bacillus sp.BSD-8）,酶纯化后对其性质研究发现,与已报道的SOX相比,该酶的热稳定性更好,这一点对于临床肌酐检测有较高的实际应用价值.因此本研究对该酶进行了深入的研究。此外,发现该菌可以在以肌酐为唯一碳源的条件下生长,推测该菌株很可能还能产生肌酸水解酶、肌酐水解酶。本研究首先对肌氨酸氧化酶基因进行了克隆、表达,采用定向进化技术和建立的高通量筛选方法对肌氨酸氧化酶的热稳定性进行改造;之后对肌酸水解酶基因进行了克隆、表达,酶性质研究;对肌酐水解酶基因进行了克隆、测序。论文的主要研究结果如下:1 Bacillus sp.BSD-8肌氨酸氧化酶基因的克隆、测序与表达:利用染色步移的方法克隆到BSD-8菌株SOX的全序列,该基因的大小为1164 bp,可编码387个氨基酸。与Genbank数据库中单亚基肌氨酸氧化酶的氨基酸序列同源性很高。成功构建了两套表达系统:一高效表达载体pET-15b（－）和BL21（DE3）的表达系统,特点为加入诱导物IPTG时蛋白高效表达,表达蛋白SOX约占细胞总蛋白的30%;二克隆载体pBluscript KS（+）Ⅱ和E.coli DH 5α的表达系统,特点为含蓝白斑筛选标记,阳性克隆子显白斑易于鉴定,不需要加诱导物IPTG酶得到表达,表达量约为上述表达系统的一半,可用于之后的定向进化筛选实验。2肌氨酸氧化酶的纯化与酶性质的研究:大肠杆菌表达的肌氨酸氧化酶经带Ni-IDA柱一步纯化后,得到的纯酶经SDS-PAGE电泳后表现为一条带,分子量为51 KDa,酶的比活为28.6 U/mg。重组SOX与来源于BSD-8的酶性质基本相同。该酶在pH8.5,温度60℃时反应活性最高;其在60℃以下,pH7.0-10.0范围内可稳定存在;以肌氨酸为底物的Km值为3.1mM,其转换常数Kcat为24/s。唯独与黄素的结合方式不同,重组酶是以共价键与黄素结合,而BSD-8的SOX是以非共价键与黄素结合。3热稳定性肌氨酸氧化酶的定向进化:通过易错PCR、定点突变相结合,建立了肌氨酸氧化酶的定向进化策略;微孔板结合表面活性剂破壁的酶活测定方法可以有效的用于耐热肌氨酸氧化酶的筛选;对肌氨酸氧化酶进行定向进化和筛选,获得了热稳定性显著提高的突变体,突变酶soxM2有三个氨基酸被替换,热稳定性比野生酶高5℃（由60℃提高到65℃）。4肌酸水解酶基因的克隆、高效表达及酶性质的研究:利用反向PCR的方法得到BSD-8菌株肌酸水解酶的全序列,该基因的大小为1236 bp,可编码411个氨基酸。成功构建了pET-28a-CRE和BL21（DE3）、pET-28a-CRE和BL21（DE3）pLysS两套表达系统,结果发现在宿主菌BL21（DE3）pLysS表达的重组酶量较在菌株BL21（DE3）的高1.64倍。在宿主菌BL21（DE3）pLysS表达的肌酸水解酶经硫酸铵沉淀、Ni-IDA柱纯化后,得到的纯酶经SDS-PAGE电泳后表现为一条带,分子量为54 KDa,酶比活为79.4U/mg。5肌酐水解酶基因的克隆、测序:利用DNA Walking SpeedUpTMPremix KitⅡ试剂盒克隆到BSD-8菌株肌酐水解酶的全序列,该基因的大小为747 bp,可编码248个氨基酸。与GenBank中的肌酐水解酶基因的氨基酸序列同源性较低。