αν和β1整合素通过FAK信号通路介导了Aβ对海马神经元的神经毒性作用

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第一部分原代大鼠海马神经元培养、鉴定及Aβ神经毒性模型的建立目的分离培养原代大鼠海马神经元并鉴定其纯度,建立Aβ体外神经毒性模型。方法参照文献方法分离出生1d SD乳鼠海马并体外培养神经元细胞,利用MAP-2免疫染色鉴定神经元细胞纯度。不同浓度老化的纤维化Aβ在不同时间点干预细胞,利用MTT比色法测定其细胞活性,寻找建立Aβ体外神经毒性模型最佳的时间点和浓度、结果分离后细胞表现为典型的神经元形态,且经MAP-2染色显示分离细胞纯度>95%,可用于后续的实验。老化的纤维化Aβ神经毒性呈现干预时间和浓度依赖性,10μM Aβ干预3 d时细胞存活率为正常组细胞存活率的62.3%,处理4 d时细胞存活率为正常组细胞存活率的46.9%。结论参照文献方法可成功分离并培养原代海马细胞。Aβ神经毒性呈现时间和浓度依赖性,基于整体实验考虑,选定10μM Aβ处理海马神经元3 d作为后续实验的造模方法。第二部分慢病毒载体靶向沉默原代大鼠海马神经元FAK表达siRNA的筛选目的针对黏着斑激酶(focal adhension kinase, FAK)基因PtK2制备靶向性RNAi慢病毒载体,包装后测定病毒浓度并转染大鼠原代海马神经元细胞,筛选最佳的感染条件和沉默靶点序列。方法依据siRNA原理设计3条大鼠海马神经元FAK基因PtK2的靶向性siRNA序列(S1, S2, S3),经酶切、转化、PCR鉴定、阳性克隆测序并慢病毒包装、测定病毒浓度。利用荧光显微镜观察各组细胞GFP表达测定不同条件下慢病毒转染效率,Real-time PCR检测神经元细胞FAK基因表达,Western blot检测FAK蛋白表达。结果成功制备3条靶向性FAK基因PtK2的siRNA慢病毒载体并成功转染到大鼠海马神经元细胞中,在感染复数为10并加入5μg/ml polybrene条件下慢病毒感染率达到90%以上。S1、S2、S3均可抑制FAK基因及蛋白的表达,但S1沉默效果最佳,敲除效率可达到65%,与正常组比较有均有统计学差异(P<0.05)。结论筛选出最佳的感染条件及最佳沉默靶向性序列S1,为后续研究整合素在AD发病中的机制提供了前期实验基础。第三部分αν和β1整合素介导Aβ对海马神经元的神经毒性作用及可能机制探讨目的探讨αν和β1整合素介导Aβ对海马神经元的神经毒性作用及可能的作用机制。方法1)在10μM Aβ处理细胞前,分别用2.5μg/mL和5μg/mL的αν和β1整合素的特异性拮抗剂17E6和ab58524预处理细胞42 h,并通过MTT、流式细胞计数、TUNNEL染色等方法观察各组神经元细胞凋亡变化; 2)利用siRNA技术沉默黏着斑蛋白(focal adhension protein, FAK),选取最佳的沉默靶序列T1并MOI为10并加入转染增强剂5μg/mL polybrene的条件,转染干预各组细胞并观察各组细胞的凋亡变化; 3)通过real-time PCR和Western blotting方法测定各组细胞FAK、ρFAK的基因和蛋白表达情况,探讨αν和β1整合素介导Aβ对元代培养海马神经元凋亡的可能机制和信号通路。结果1)MTT结果显示,17E6和ab58524均可增加Aβ诱导的海马神经元的存活率,与Aβ处理组比较有显著差别(分别为P<0.01, P<0.05),而siFAK后,17E6和ab58524的神经保护作用明显减弱; 2)TUNEL染色及流失细胞计数法显示,17E6和ab58524可抑制Aβ诱导的海马神经元的凋亡,与Aβ处理组比较有显著差别(P<0.05),而siFAK后,17E6和ab58524的神经保护作用明显减弱; 3)Aβ处理均可增加FAK蛋白和基因表达,而17E6、ab58524预处理后FAK基因和蛋白表达水平下降,可其磷酸化FAK蛋白表达水平却升高。siFAK后,细胞FAK及磷酸化FAK基因、蛋白表达水平均明显下降(P<0.05)。结论αν及β1整合素均参与并介导了Aβ诱导的海马神经元毒性作用,其机制可能激活Itg-FAK信号通路相关。
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