第一部分慢病毒介导的MAPK基因沉默对雌二醇作用子宫内膜癌细胞Ishikawa的影响1慢病毒shRNA载体构建并建立稳定转染的Ishikawa细胞株[目的]本课题组前期发现雌二醇可以通过MAPK信号通路促进子宫内膜癌细胞的发生发展,为明确MAPK信号通路对雌二醇作用子宫内膜癌细胞的相关机制,我们利用RNAi沉默子宫内膜癌细胞Ishikawa中的MAPK基因,并筛选稳定表达的细胞株,为探究MAPK基因低表达对雌二醇作用子宫内膜癌细胞的影响奠定基础。[方法](1)设计合成4组特异性针对MAPK基因的siRNA,构建shRNA质粒载体,感染Ishikawa细胞。(2)利用RT-PCR和Western blot实验检测各组对目的基因的抑制效果,筛选出沉默效果最佳的靶点。(3)将选取的最佳靶点包装成慢病毒shRNA载体,感染Ishikawa细胞。(4)将感染目的基因的细胞Ishikawa,经流式分选获得稳定的细胞株,采用RT-PCR和Western blot实验检测各组对目的基因的抑制效果。[结果](1)RT-PCR和Western blot筛选出最佳干扰靶点,siRNA序列为:GGACTGTCTCTGGTAGAGATGGCGGTTGG(2)测序证实:运用特异性针对MAPK基因的siRNA,成功构建了慢病毒shRNA载体,包装滴度为3×108TU/ml。感染Ishikawa细胞后,荧光倒置显微镜观察及流式细胞仪检测,显示各组感染效率均在90%以上,病毒感染成功。(3)流式细胞仪分选后,RT-PCR和Western blot验证干扰效率,获得稳定转染的细胞株。[结论]RNA干扰技术可有效抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa中的MAPK基因表达,为后续实验奠定基础。2慢病毒介导的MAPK基因沉默对雌二醇作用子宫内膜癌细胞Ishikawa的体外影响[目的]利用RNA干扰技术抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa中MAPK基因的表达,检测MAPK基因低表达对雌二醇作用Ishikawa细胞后相关基因、蛋白的影响,及对细胞存活能力、周期、凋亡影响,探究MAPK基因低表达对雌二醇作用子宫内膜癌细胞Ishikawa的影响及潜在机制。[方法]课题组前期研究发现:应用10-6mol/L雌激素刺激细胞30min效果最佳。实验分四组:(l)Control组:无雌二醇刺激的Ishikawa细胞;(2)Ishikawa 细胞组:经 10-6mol/L 雌二醇刺激的 Ishikawa 细胞;(3)NC 组:经10-6mol/L雌二醇刺激转染阴性慢病毒的Ishikawa细胞;(4)MAPK组:经10-6mol/L雌二醇刺激前期构建的MAPK-RNAi细胞。(1)RT-PCR和Western blot实验检测雌二醇作用四组细胞后VEGF、bFGF mRNA和蛋白的表达。(2)MTT实验检测四组细胞生长情况,分析MAPK基因沉默前后对Ishikawa细胞生存率的影响。(3)细胞迁移实验Transwell检测四组细胞体外迁移能力,分析MAPK基因沉默前后对Ishikawa细胞体外迁移能力的影响。(4)流式细胞仪检测四组细胞周期及凋亡率变化,分析MAPK基因沉默前后对Ishikawa细胞周期及凋亡的影响。[结果](1)Ishikawa组VEGF、bFGF基因及蛋白表达明显增加,与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05) ; NC组与Ishikawa组相比差异无统计学意义(p>0.05); MAPK组VEGF、bFGF基因及蛋白表达明显减少,与shikawa组比较差异有统计学意义(p<0.05)。(2)MTT结果显示:Ishikawa组细胞倍增时间明显加快,与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05) ; NC组与Ishikawa组相比差异无统计学意义(p>0.05); MAPK组细胞倍增时间明显延长,与shikawa组比较差异有统计学意义(p<0.05)。(3)迁移结果显示:Ishikawa组穿过微孔的细胞数明显增加,与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05); NC组与Ishikawa组相比差异无统计学意义(p>0.05); MAPK组穿过微孔的细胞数明显减少,与shikawa组比较差异有统计学意义(p<0.05)。(4)细胞凋亡结果显示:Ishikawa组细胞总凋亡率(%)明显下降,与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05) ; NC组与Ishikawa组相比差异无统计学意义(p>0.05); MAPK组细胞中晚期凋亡率、总凋亡率(%)均明显增加,与shikawa组比较差异有统计学意义(p<0.05)。(5)细胞周期结果显示:Ishikawa组细胞G0/G1期比率明显下降,与对照组相比差异有统计学意义(p>0.05); NC组与Ishikawa组相比差异无统计学意义(p>0.05); MAPK组细胞G0/G1期明显增加,S期和G2期减少,与shikawa组比较差异有统计学意义(p<0.05)。[结论]MAPK基因低表达可以干扰E2在基因及蛋白水平激活子宫内膜癌细胞产生VEGF、bFGF,可以下调E2对子宫内膜癌细胞增殖的促进作用和凋亡的抑制作用。3构建MAPK基因低表达Ishikawa细胞裸鼠移植瘤模型[目的]构建MAPK基因低表达Ishikawa细胞裸鼠移植瘤模型,观察MAPK基因低表达对子宫内膜癌裸鼠移植瘤生长的影响,探究MAPK基因能否成为子宫内膜癌基因治疗的分子靶点。[方法]将BALB/C裸鼠随机分为3组,每组6只。实验分组:(1) Ishikawa 组:经 10-6mol/L 雌二醇刺激的 Ishikawa 细胞;(2) NC 组:经10-6mol/L雌二醇刺激转染阴性慢病毒的Ishikawa细胞;(3) MAPK组:经10-6mol/L雌二醇刺激的MAPK-RNAi细胞。将细胞分别接种于裸鼠右侧背部。观察移植瘤成瘤情况及肿瘤生长情况,成瘤后,用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)。按照肿瘤体积计算公式:V=0.5×a×b2来计算肿瘤体积,并绘制肿瘤生长曲线。应用Western Blot检测各组MAPK信号通路相关蛋白的表达。[结果]成功构建子宫内膜癌裸鼠移植瘤模型。MAPK组裸鼠移植瘤增长速度明显减慢、瘤体重量减少、蛋白MAPK、VEGF、bFGF的表达明显降低,与Ishikawa组、NC组相比差异有统计学意义(p<0.05);而Ishikawa组移植瘤增长速度、瘤体重量、蛋白MAPK、VEGF、bFGF的表达,与NC组相比差异无统计学意义(p>0.05)。[结论]MAPK基因低表达抑制子宫内膜癌裸鼠移植瘤的生长,提示MAPK基因有可能成为子宫内膜癌基因治疗的分子靶点。第二部分基于TMT标记联合LC-MS/MS技术筛选雌激素作用Ishikawa细胞后的差异蛋白研究[目的]使用TMT定量蛋白组学技术研究雌激素作用子宫内膜癌细胞Ishikawa后差异表达的蛋白质,寻找与子宫内膜癌相关的诊断标志物及探索子宫内膜癌的发病机制。[方法]实验分2组:(1))Control组:无雌二醇刺激的Ishikawa细胞;(2)雌激素组:经10-6mol/L雌二醇刺激的Ishikawa细胞。本实验利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,采用基于TMT的蛋白组学技术分析不同分组的Ishikawa细胞差异蛋白,选取差异表达的蛋白质进行液相色谱仪联合质谱分析,借助生物信息学方法筛选出有重要价值的蛋白质,Mascot软件搜索Uniprot数据库鉴定差异蛋白质,采用In Cell ELISA技术验证其表达的规律。[结果](1)经TMT定量蛋白组学分析,共筛选出92个差异蛋白,其中上调蛋白80个,下调蛋白12个;(2)差异蛋白的亚细胞定位主要集中在细胞核上;(3)差异蛋白主要参与10条代谢通路代谢通路,主要是mTOR信号通路(参与蛋白:RPS6KA1)、RNAtransport 通路(参与蛋白:NCBP1; RPP30;EIF3B; Pinin; ACIN1)及 mRNA surveillance pathway 通路(参与蛋白:NCBP1; Pinin; ACIN1);(4)使用生物信息学方法对这92个差异蛋白进行全面分析,并采用In Cell ELISA技术对差异蛋白RPS6KA1进行验证,表达趋势与质谱一致。[结论](1)本研究证明基于TMT标记联合LC-MS/MS技术可作为鉴定筛选子宫内膜癌差异蛋白的有效方法;(2)雌激素组蛋白RPS6KA1表达明显增加,推测雌激素可以通过mTOR信号通路影响子宫内膜癌的发生发展。