【摘 要】
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麦芽糖是不加糖面团中主要的可发酵性糖,因此麦芽糖的利用速度是面包酵母发酵能力的影响因素。α-葡萄糖苷酶在麦芽糖代谢过程中起主导作用并且葡萄糖的存在会对α-葡萄糖苷酶活力产生一定的抑制作用,因此提高α-葡萄糖苷酶活力及减弱葡萄糖抑制作用是提高麦芽糖代谢速度的有效途径。本论文通过易错PCR、点突变及DNA重排三种定向进化手段相结合对面包酵母中的α-葡萄糖苷酶进行定向改造,通过高通量筛选获得3株α-葡萄
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麦芽糖是不加糖面团中主要的可发酵性糖,因此麦芽糖的利用速度是面包酵母发酵能力的影响因素。α-葡萄糖苷酶在麦芽糖代谢过程中起主导作用并且葡萄糖的存在会对α-葡萄糖苷酶活力产生一定的抑制作用,因此提高α-葡萄糖苷酶活力及减弱葡萄糖抑制作用是提高麦芽糖代谢速度的有效途径。本论文通过易错PCR、点突变及DNA重排三种定向进化手段相结合对面包酵母中的α-葡萄糖苷酶进行定向改造,通过高通量筛选获得3株α-葡萄糖苷酶活力提高及葡萄糖抑制作用减弱的突变体,并对酶学性质及构效关系进行研究。主要研究结果如下:(1)利用易错PCR构建编码α-葡萄糖苷酶的基因突变文库,通过高通量筛选对突变文库进行初筛,将初筛获得的37株突变体进行复筛,获得2株相对比酶活力提高倍数较高的突变体,其相对比酶活分别达到α-葡萄糖苷酶野生型的1.4和1.5倍。对α-葡萄糖苷酶野生型和突变体的酶学性质进行研究,发现突变体MALep1和MALep2中α-葡萄糖苷酶的最适反应温度均为30℃,与野生型相比降低5℃。在低于35℃时,MALep1中α-葡萄糖苷酶的热稳定性优于野生型,在超过35℃时酶的热稳定性迅速下降。MALep2的热稳定性低于野生型。突变体的最适反应pH未发生改变,但是突变体酶的pH稳定性变差。葡萄糖对突变体酶活力的抑制作用减弱。通过测序发现两个突变体都发生了有义突变,通过同源建模分析突变位点与空间结构的关系发现,氨基酸的突变导致蛋白质的内部空间增大,可能使底物更容易进入活性口袋,能够更好的催化底物的水解。(2)对突变体MALep2各突变位点进行单点定点突变研究,分析突变位点与α-葡萄糖苷酶活力之间的关系。研究结果证明D440V突变导致α-葡萄糖苷酶活力提高,其余3个位点的突变未对α-葡萄糖苷酶活力产生积极影响。通过同源建模发现,突变导致第440位氨基酸与周围氨基酸之间形成的氢键减少,使α-螺旋的柔性增大,并且增加了氨基酸之间的间距,可能使底物更容易进入蛋白质内部,但由于氢键的减少导致酶的稳定性变差。(3)以易错PCR获得α-葡萄糖苷酶的突变体为模板进行DNA重排,通过初筛得到的72株突变体,经过复筛获得一株突变体MALDs3,突变体的α-葡萄糖苷酶相对比酶活力达到α-葡萄糖苷酶野生型的1.7倍。通过分析葡萄糖对α-葡萄糖苷酶野生型和突变体活力的影响,发现葡萄糖对α-葡萄糖苷酶突变体的抑制作用减弱。通过测序发现,与α-葡萄糖苷酶野生型的氨基酸序列相比,突变位点不仅来自于模板还引入了一个新的突变位点K425E。通过同源建模及蛋白质活性口袋预测发现突变位点位于活性口袋附近,因此推测突变体酶活力提高可能是由于突变导致活性口袋发生改变,从而影响了催化位点对底物的水解能力。
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