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[背景／目的]乙型肝炎病毒(HBV)非常容易造成感染的慢性化,但是其慢性化的发病机制机制目前还没有完全研究清楚。近几年来的研究成果表明,外周血淋巴细胞的凋亡和免疫耐受的发生与HBV感染的慢性化有密切的关系。活化诱导的细胞死亡(AICD)是指已经激活的成熟淋巴细胞(T淋巴细胞或B淋巴细胞)在抗原呈递细胞和细胞因子如IL-1、IL-2的辅助作用下被抗原性物质或其他因素活化后,当再一次受到激活信号(尤其是T细胞受体／CD3复合物等)刺激后分泌TNF等细胞因子或通过表达FasL等膜蛋白从而诱导自身所发生的细胞凋亡。外周血淋巴细胞通过激活诱导的细胞死亡,不仅可以维持机体的免疫稳态,也可能是导致机体外周免疫耐受形成的重要因素。外周血单个核细胞(PBMC)即外周血中具有单个细胞核的细胞,主要由大量的淋巴细胞组成,除此之外还包括少量的自然杀伤细胞(NK)、单核巨噬细胞等各种免疫活性细胞,在机体对抗外来抗原的免疫反应尤其是特异性的细胞免疫反应中起重要作用。细胞凋亡是机体为了维持内环境的稳态,在各种细胞因子的共同参与和凋亡相关基因的严格调控下,发生的一系列有步骤的裂解过程,是一种生理性的细胞死亡。细胞的凋亡路径和信号转导通路的确切发生机制到目前为止还没有完全搞清楚。根据起始激活的Caspase家族成员不同,细胞凋亡的激活途径可以分为三种：第一种是死亡受体途径,又称为外源性途径,通过FAS配体(FASLG)与FAS(CD95)的结合而触发凋亡。FAS-FASL结合以后,通过一系列的信号转导反应,导致凋亡蛋白酶8(CASP8)的激活,随后活化的凋亡蛋白酶8又可以进一步激活凋亡效应器即凋亡蛋白酶3,凋亡蛋白酶6,凋亡蛋白酶7(CASP3, CASP6, CASP7),由凋亡效应器执行下面的凋亡过程。第二种是线粒体途径, 又称为内源性途径,在凋亡信号的刺激下,原本储存在线粒体膜间隙的凋亡诱导因子(AIF)、细胞色素C (CytC)等释放出来到胞浆中诱导细胞凋亡。 在ATP/dATP存在的前提条件下,位于膜间隙中的大量CytC释放处理进入到胞浆,然后与Apaf-1形成多聚复合体,通过Apaf-1 N-末端的Caspase-募集结构域(CARD)招募聚集胞质中的caspase-9,并诱导其活化进而导致细胞凋亡。第三种是内质网途径,在应激状态下促使caspase-7由胞浆转移到内质网表面,同时内质网诱导caspase-12的表达增加。由Caspase-7进一步激活caspase-12,而后者激活后又可进一步剪切加工caspase3,进而诱导细胞凋亡发生。本次研究的目的在于探讨慢性HBV感染者PBMC中是否存在AICD现象, 外周血淋巴细胞不同的凋亡路径,及其在HBV感染慢性化过程中作用。[方法]1.入选标准和排除标准：慢性HBV携带者9名,慢性乙型肝炎患者48名(其中轻度患者14例,中度患者22例,重度患者12例),肝硬化患者24名,所有入选患者的诊断符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》的诊断标准,并排除甲、丙、丁和戊型肝炎及其他原因所致的肝损害。20例健康人为正常对照组。2.标本采集：严格按照无菌操作的原则,采集空腹静脉血7ml,加入EDTA抗凝。其中3ml离心(2000r/min,5min)获得血浆,-80℃保存备用。4ml新鲜全血用Ficoll密度梯度离心法提取PBMC,-80℃保存备用。3.提取总RNA,测定RNA浓度和纯度取出冻存的PBMC,室温条件下解冻5min,然后加入lml Trizol,严格按照试剂盒说明书规范操作,提取总RNA,测定RNA浓度和纯度,保证A260/A280在1.8~2.0。4.实时荧光定量PCR检测PBMC中FAS, CASP-8, CYCS, CASP-9, CASP-3的表达。5.采用“双抗体一步夹心法”酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆中CASP-8, CASP-9, CASP-3的表达。[结果]1.实时荧光定量PCR结果显示：CHB组和ASC组凋亡相关基因(FAS,Caspase-8, CYCS, Caspase-9, Caspase-3)的表达明显高于NC组和LC组,差异具有统计学意义(P<0.05),LC组高于NC组,差异有统计学意义(P<0.05),而CHB组和ASC组差异无统计学意义(P>0.05)。2. ELISA结果显示：血浆Caspase-9, Caspase-8, Caspase-3浓度由高到低依次为CHB组和ASC组>LC组>NC组,差异有统计学意义(P<0.0083), CHB组和ASC组差异无统计学意义(P>0.0083)。3. ELISA结果显示：HBV-DNA阳性组血浆Caspase-9, Caspase-8, Caspase-3的浓度均明显高于HBV-DNA阴性组,差异有统计学意义(P<0.05)。4. ELISA结果显示：血浆Caspase-9, Caspase-8, Caspase-3浓度水平由高到低依次为：慢性乙肝(轻度)组>慢性乙肝(中度)组>慢性乙肝(重度)组,差异具有统计学意义(P<0.01)。[结论]HBV感染可以诱导外周血单个核细胞的凋亡(即AICD),内源性路径(即线粒体途径)和外源性路径(死亡受体途径)均参与其中,PBMC的凋亡在HBV感染慢性化过程中发挥了重要作用。