论文部分内容阅读
目的:临床医学对大段周围神经缺损的修复有迫切需求,然而目前构建的神经移植物的血管化问题是困扰大段周围神经缺损修复的重要瓶颈之一。本项目在前期构建组织工程化周围神经的基础上,认为移植物早期血管化对组织工程化周围神经在体内存活起重要作用,提出促血管化组织工程化周围神经促进大段周围神经缺损修复的新方法,即利用携带血管内皮生长因子165基因(VEGF165)的重组腺病毒转染自体内皮祖细胞(EPCs),并与自体脂肪干细胞(ADSCs)诱导后的类许旺细胞共同作为种子细胞,利用本课题组改良制备的同种异体脱细胞神经支架材料作为载体,构建促血管化组织工程化周围神经,并修复大鼠坐骨神经大段缺损(2cm),通过大体观察、神经电生理检测、组织学观察等方法评估神经修复情况。探讨基于VEGF165基因及EPCs促血管生成作用构建的神经移植物对动物体内大段神经缺损修复的影响。方法:1、取SD大鼠,无菌分离双侧胫骨及股骨,采用骨髓EPCs分离液分离大鼠EPCs并进行鉴定。采用酶消化法获取大鼠ADSCs,并采用经典诱导方法将其向许旺细胞进行诱导,并进行鉴定。将上述两种细胞按照不同接种比例进行共培养(1:2,1:1及2:1),测定不同比例下EPCs对ADSCs诱导后的类许旺细胞生物学行为的影响。以此来确定EPCs与类许旺细胞共培养时的最佳比例。2、在体外构建含VEGF165基因的复制缺陷型腺病毒表达载体Ad-VEGF165,并对其进行鉴定;经过多次感染、扩增和纯化等一系列步骤,获得重组腺病毒载体Ad-VEGF165,之后采用终点稀释法对上述病毒载体的滴度进行测定,计算Ad-VEGF165滴度。测定腺病毒转染的最佳浓度,在此浓度的基础上将Ad-VEGF165转染大鼠EPCs;通过CCK-8检测腺病毒转染后对EPCs存活的影响;通过Transwell小室检测腺病毒转染后对EPCs迁移的影响;细胞免疫荧光、Matrigel基质胶体外成血管实验、荧光定量PCR及Western-blot检测腺病毒转染后对EPCs功能表达的影响。3、按照实验(1)所得出的共培养细胞比例,将实验(2)所构建的转染VEGF165后的EPCs与ADSCs诱导后的类许旺细胞共同作为种子细胞;将其采用显微注射法注入课题组先前制备的改良脱细胞周围神经支架;构建促血管化组织工程化周围神经。通过病理HE染色、扫描电镜及Live/Dead荧光染色观察其在体外的生长情况。4、采用实验(3)所制备的促血管化组织工程化周围神经修复大鼠坐骨神经缺损(长度为2cm),分别以自体神经移植、普通组织工程化周围神经为对照组,通过对各组大体观察、神经电生理检测、组织学观察等来比较各组移植物血管化程度及神经修复情况。结果:1、通过将大鼠EPCs与ADSCs诱导后的类SCs共培养,我们获得了上述两种细胞共培养的最佳比例(1:1);并发现在该比例下,EPCs能够促进类SCs存活及功能表达等生物学行为,且该现象可能是通过Wnt/β-catenin信号通路所介导。2、体外成功构建携带VEGF165基因的重组腺病毒表达载体Ad-VEGF165,MOI=200时成功转染大鼠EPCs,通过一系列检测表明转染VEGF165基因能促进EPCs增殖、迁移及向内皮细胞分化,提高EPCs成血管能力,这一现象可能是通过Notch/Jagged信号通路所介导。3、采用转染VEGF165基因的EPCs与自体ADSCs诱导后的类SCs共同作为种子细胞,利用本课题组改良制备的脱细胞神经支架材料作为载体,成功构建了促血管化组织工程化周围神经,并在体外生长良好。4、综合病理学、大体观察、超声及神经电生理等结果,表明基于EPCs及VEGF165基因预血管化策略能促进组织工程神经尽早地实现血管化,恢复神经移植区的血供。神经缺损区域早期血管化的实现极大地促进了神经缺损区域的神经再生、重建速度,使得神经重建与修复进程能够大大提前。结论:基于EPCs及VEGF165基因促血管生成作用能够促进组织工程化周围神经在体内早期血管化,加速恢复周围神经的正常形态结构及功能,促进周围神经缺损的修复重建。