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龋病是一种极大危害人类口腔健康和全身健康的常见病、多发病,对龋病的主要病原因子--牙菌斑特性的研究一直是口腔医学界关注的焦点.现代龋病学的研究认为,菌斑中的正常菌丛组成存在着动态平衡,当这一平衡受到干扰时,大量具有致龋潜力的产酸耐酸菌毒力和数量显著增多,非致龋性菌斑就会向致龋性菌斑转变,从而发生龋病.目前口腔中存在的微生物多达700种以上,其中至少有一半以上的微生物仍然是不可培养或者难于培养的,因而对这一菌斑生态失衡致龋学说的验证仅限于几种主要的致龋菌,尚缺乏对于龋病发生发展过程中菌群组成变化及作用的全面认识,以及对龋病易感人群患龋风险较为全面的微生物学评估标准.
现代分子生物学技术的进步使得研究者们可以全局性的探索生态群落中微生物种群的变迁.本研究选择不同龋敏感儿童牙菌斑作为研究对象,采用变性梯度胶电泳(denaturing gradient gel electropho-resis,DGGE)分子生物学策略分析16S rDNA、mpB特征序列,从"属"、"种"的水平分别对菌斑中细菌类群以及口腔链球菌属群落进行鉴定;并进一步应用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time polymerasechain reaction,Real-time.PCR)、荧光原位杂交(nuorescence in situhybridization,:FISH)、流式细胞仪(Flow cytometer,FCM)等多种分子生物学方法对其中的主要致龋菌进行定量分析.研究主要结果如下:
第一部分龋易感儿童牙菌斑细菌群落组成多样性PCR-DGGE分析
本部分实验通过儿童龋高危人群临床资料的队列研究,获得各15名无龋(dmrs=0)、中龋(4≤dmfs≤6)以及高龋(dmfs≥8)菌斑样本,利用PCR-DGGE技术结合16S rDNA,动态分析不同致病条件下菌斑中细菌群落组成多样性.结果显示,健康儿童组不同个体之间牙菌斑细菌种群整体结构基本一致,优势菌属为链球菌属中的口腔链球菌群(Oralis streptococus) 和变异链球菌群 (Mutans streptococus)、放线菌属 (Actinom,yces)、噬二氧化碳细胞菌属(亦称二氧化碳噬纤维菌属,Capnocytophaga)、弯曲杆菌属 (Campylobacter)、伯克氏菌属(Burkholderia)、奈瑟菌属 (Neisseria)、纤毛菌属 (Leptotrichia)、嗜血杆菌属 (Haemophilus)、普氏菌属 (Prevotella)和棒杆菌属(Corynebacterium).
其中变异链球菌群与放线菌属在中龋、高龋儿童中均有着稳定的检出率,是主要的致龋菌;口腔链球菌群与龋病的发生呈负相关.而且随着菌斑的致龋化转变,高龋组的遗传多样性显著减少(P<0.05).
第二部分龋易感儿童牙菌斑口腔链球菌属群落组成多样性PCR-DGGE分析
链球菌属系统分类发育标记分子rnpB基因,可以将链球菌精确鉴定到菌种的水平.在第一部分的研究基础上,本部分实验进一步对主要致龋菌属--口腔链球菌属(Oral streptococci)的细菌类群多样性进行了分析.结果显示,在45例无龋、中龋以及高龋儿童牙菌斑中,共鉴定出23种链球菌,分别归属于口腔链球菌群:血链球菌(streptococcus.sanguis,s.sanguis),轻链球菌(Streptococcus mitis,S.mitis),口腔链球菌(streptococcus oralis,S.oralis),嵴链球菌(Streptococcus scrista,S.scrista);变异链球菌群:变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans),远缘链球菌(Streptococcus sobrinus,S.sobrinus);中间链球菌群(Intermedius streptococcus):咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus,S.anginosus).其中口腔链球菌群和变异链球菌群在无龋、中龋和高龋组中有着较高的检出率,是菌斑中的常居优势菌丛,中间链球菌群只在个别样本中检出.
儿童无龋组血链球菌、轻链球菌、口腔链球菌的基因型显著高于中龋和高龋组(P<0.05);而变异链球菌和远缘链球菌的基因型在三组之间虽然并无区别(P>0.05),但在后两组中条带亮度明显增加,说明变异链球菌和远缘链球菌在菌斑的致龋化转变过程中,仍然继续保持优势生长状态,是主要的致龋菌,而且二者常常可以并行检出提示这两种细菌可能存在着共生、协同致龋作用.
第三部分龋易感儿童牙菌斑中变异链球菌的定量检测
变异链球菌作为公认的主要致龋菌,其在口腔存在的数量和比例,可以作为龋齿活跃性评估的参考数据之一.本部分试验通过不同荧光素标记的寡核苷酸探针:变异链球菌特异性探针MUT590和细菌通用探针EUB388,与无龋组、高龋组儿童菌斑中变异链球菌与总菌杂交,结合流式细胞仪定量检测.结果显示在无龋儿童组菌斑中,变异链球菌在总菌中所占的比例分别是1.24﹪～3.4﹪,而在高龋儿童菌斑中比例为5.04﹪～9.7﹪,两组比较有着明显的统计学差异(P<0.01).荧光原位杂交技术结合流式细胞术,数据可靠、特异性高、省时,是一种定量分析变异链球菌的理想方法.
第四部分龋易感儿童牙菌斑四种主要致龋菌实时PCR定量检测
龋病是一种多种细菌共同作用所引起的慢性感染性疾病,本部分实验应用Real-time PCR定量检测变异链球菌、远缘链球菌、黏性放线菌(Actinomyces viscosus,Aviscosus)和内氏放线菌(Actinomycesnaeslundii,Anaeslundii).结果显示变异链球菌在中龋组中所占的百分比例为8.84±5.99,显著高于无龋组(P<0.01),数值与第三部分应用荧光原位杂交和流式细胞仪定量检测所得的龋病高危人群的临界参数接近;但与高龋组相比,变异链球菌比例虽有明显增长,却和dmfs指数的增加并非呈线性关系,统计学分析亦无显著差异(P<0.05);远缘链球菌作为另一主要致龋菌,其检出率及数量水平虽不如变异链球菌(P<0.01),但在无龋、中龋和高龋三组中与变异链球菌有着一致的统计学变化趋势,并且常在检出变链菌的个体中检出,二者之和所占总菌的比例,在三组之间两两比较不但均有统计学意义(P<0.05),而且和dmfs指数的变化有着良好的线性关系,提示这两种细菌在致龋方面可能具有协同作用,而且二者数量之和所占总菌的比例更适合用于龋齿活跃性的评估.
黏性放线菌、内氏放线菌作为菌斑形成过程中的先锋菌,在高龋组中的比例显著高于无龋组(P<0.01),说明在酸化的致龋性菌斑中,二者仍然可以保持良好的生活状态并继续分裂增殖,在龋病的发生发展过程中,可能起着较为重要的作用.