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胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App)是引起猪胸膜肺炎的病原体,胸膜肺炎是一种具有高度传染性的严重猪疾病,对全球各地的养殖业均造成了巨大的经济损失。猪胸膜肺炎以急性出血及慢性纤维素性胸膜肺炎为特征,可通过接触传染。AdhE是一种双功能酶,具有乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶的催化活性。近年来,大量研究结果表明AdhE在细菌感染宿主的过程中也发挥着重要调控作用。本试验以App 7型菌株感染小鼠肺组织后通过互作转录组分析获得的差异表达基因为前提,选取上调基因中差异表达倍数最高的基因AdhE作为研究对象。对该基因所编码的AdhE蛋白进行了基因克隆和原核表达,对该重组蛋白的免疫原性及其对小鼠的免疫保护作用进行了探究。1.App7型AdhE蛋白的原核表达及其免疫原性分析通过扩增App7型菌株的AdhE全基因,对其所编码的蛋白进行生物信息学分析,发现该蛋白高度保守。为了分析AdhE蛋白的免疫原性,本试验成功构建pET-32a(+)-AdhE大肠杆菌表达载体,于大肠杆菌BL21中表达,成功表达大小约为110kDa的蛋白。以纯化的rAdhE蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,结果显示在加强免疫后的小鼠血清中能检测到较高的IgG抗体水平,抗体滴度的对数值能达到lg=4.609,Western blot特异性检测结果显示,多克隆抗体中含有高水平抗rAdhE特异性抗体,进一步证明AdhE具有很强的免疫原性。2.App7型AdhE蛋白的免疫保护性分析本试验通过小鼠的攻毒保护性试验、肺组织病理切片分析以及监测以非致死剂量App感染小鼠前和感染后4、8、12、24、48h小鼠的细胞因子表达水平,对App的AdhE蛋白能否对App感染小鼠提供有效的免疫保护力进行评估。以致死剂量App7型或App1型菌株腹腔注射攻毒试验小鼠,结果显示PBS组小鼠均在36h内全部死亡,rAdhE组小鼠分别能获得获得90%(App7)或70%(App1)的保护力,保护力均略低于疫苗组的100%。组织病理学观察结果显示,相较于PBS组小鼠肺组织严重病变呈间质性肺炎且组织中有大量炎性细胞浸润,rAdhE组小鼠的肺组织病变较为轻微,仅肺泡壁以及支气管周围可见少量以中性粒细胞为主的炎性浸润,但是rAdhE组小鼠肺组织中的炎性细胞数量仍然略高于疫苗组免疫的小鼠肺组织。细胞因子监测结果发现,rAdhE组小鼠在感染App前即可诱导机体产生IFN-γ,激活宿主的天然免疫;在感染App初期4h内,PBS组和rAdhE组三种细胞因子相较感染前均呈现出显著高表达现象,小鼠为应对急性炎症而刺激机体产生大量炎性细胞因子;随着感染病程的发展,可明显观察到相较于PBS组小鼠,rAdhE组的小鼠IL-6、TNF-α和IFN-γ的表达显著受到了抑制,使得小鼠在感染12h内便将炎症反应控制在较低的水平,表明AdhE具有良好的免疫调节作用,通过调控小鼠体内IL-6、TNF-α和IFN-γ细胞因子的含量有效控制了细菌感染后的炎症反应。本研究证明了高度保守的AdhE蛋白具有良好的免疫原性以及免疫调节作用,具有抗App1和App7感染的交叉免疫保护作用。