妇科千金胶囊(FKQJ)是妇科常用中成药,由千斤拔、功劳木、金樱根、单面针等组成,具有清热除湿、补益气血化瘀活血等功效,临床用于治疗多种妇科疾病。FKQJ现行药典标准质控仅限于测定穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量,而对于其他成分则无质量控制测定标准。个别化学成分不能反映整体复方制剂的专属性、代表性、价值性,个别指标性成分的定性定量分析不能反应复方制剂的整体疗效和安全性,也不能很好地关联临床功效和作用机制,难以客观、全面和准确地评价中药复方制剂的内在质量。为确保质量稳定一致,本研究以FKQJ为例,开展以生物评价为核心、整合多种质控方法的研究,更好地助力FKQJ的质量控制,同时为中药大复方制剂质量评控提供新的思路和参考,主要研究分为以下几个部分:1.基于多组学预测、筛选抗炎活性靶点,为生物评价研究提供生物学指标选择依据利用网络药理学方法,收集FKQJ的主要化学成分,针对其抗炎药效作用,构建“药物-靶标-疾病”网络,筛选、预测FKQJ的主要作用靶标和通路。通过对网络拓扑参数的分析,筛选FKQJ抗炎的主要效应靶标共64个,其中包括37个直接作用靶标和27个间接作用靶标。FKQJ主要是与酶、蛋白等结合,通过激活RNA聚合酶II启动子的转录、抑制凋亡等生物过程发挥抗炎作用,主要影响的信号通路TNF、凋亡、MAPK、T细胞受体等。针对效应细胞富集结果表明,FKQJ抗炎靶标在巨噬细胞、中性粒细胞和浆细胞中显著富集(p<0.01)。其中巨噬细胞是其抗炎的主要效应细胞,而巨噬细胞浸润是慢性炎症的主要特点。综合上述分析,可以初步得出如下结论:FKQJ用于治疗慢性炎症应有较好的疗效,其抗炎主要效应细胞是巨噬细胞,主要作用靶标包括PGH2、NOS2等蛋白酶以及IL-1β、IL-6和TNFα等炎性因子,主要作用通路包括TNF信号通路、NOD样受体信号通路以及Toll样受体信号通路等。该结果为后续开展FKQJ质量生物评价研究提供生物学指标选择依据。利用代谢组学技术,筛选FKQJ药物作用的生物标志物。以RAW264.7细胞为载体,采用LPS和IFN-γ联合刺激建立细胞炎症模型,考察FKQJ对于在炎症刺激下的单核巨噬细胞RAW264.7代谢产物的变化,结果表明:模型组、正常组、模型给药组代谢轮廓区分明显,提示FKQJ对小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞的代谢行为影响较大。FKQJ的抗炎作用机制可以主要通过调节与炎症、氨基酸代谢和能量代谢有关的途径来实现,其中,炎症相关通路主要影响了花生四烯酸的新陈代谢,并影响到前列腺素类标志物的产生,它的机制与酶的抑制有关。代谢组学研究结果提示,COX-2可以作为FKQJ质量生物评价的重要候选指标。2.采用点面结合的方法,分别单一靶点(酶水平)和基因表达谱(细胞水平)评价FKQJ的抗炎生物活性首次优化了基于抑制COX-2酶活性的抗炎生物效价检测方法。通过优化环氧化酶-2抑制效价检测试剂盒,提高检测效果,并通过应用加以验证。对试剂盒相关实际试剂用量和使用参数的优化,明确了试剂盒的可使用限和不可使用限。孵育时间为5min时检测结果更加理想;反复冻融次数不宜过多,最好不要超过6次;长时间贮藏应选择-20°C,未用完的试剂放回-20°C不影响使用效果,提高了试剂盒的使用率;待测抑制及的配制溶剂也会影响试剂盒的使用效果,一般选择DMSO,检测效果更好,但是并不是适用所有抑制剂的特点,要根据抑制剂具体问题具体分析。考察了底物、酶和辅助因子的用量对抑制COX-2活性影响确定其合适用量。通过方法学考察,明确了该方法精密度高(日内RSD=5.13%,日间RSD=6.56%),重复性(RSD=7.88%)好,方便重现(RSD=10.15%),可以满足生物评价方法的要求酶用量对抑制COX-2活性影响。开发了一种基于基因表达谱来评价FKQJ抗炎生物活性的方法。以小鼠巨噬细胞RAW264.7为生物检测器,在FKQJ处理24h后,使用内含有30个抗炎指标性基因引物的基因芯片和qRT-PCR筛选能够代表药物生物活性的m RNA作为指标基因。并利用KEGG对筛选结果进行了通路富集分析。结果提示,FKQJ刺激Toll-like receptor signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、TNF signaling pathway发生显著下调,但其对三条通路的作用侧重点有所不同,FKQJ主要是下调了TLR4-NF-κB-TLR2以使Toll-like receptor signaling pathway下调。在TNF信号通路中,FKQJ主要集中在下调TNF-α、IL-6、COX-2、iNOS的表达而发挥抗炎作用,初步验证了前面的网络药理学、代谢组学研究的预测结果。采用超高效液相色谱法(UPLC),测定了FKQJ中绿原酸、阿魏酸、染料木苷、药根碱、穿心莲内酯、巴马汀、小檗碱、脱水穿心莲内酯和藁本内酯9种成分含量测定方法,并建立了化学指纹图谱。测定结果表明,20批次的FKQJ化学指纹图谱相似度较高,但是9个活性成分的含量存在较大差异,批次间各成分的变异系数分别为11.34%(绿原酸)、19.14%(阿魏酸)、20.19%(染料木苷)、30.79%(药根碱)、18.19%(穿心莲内酯)、16.43%(巴马汀)、36.88%(小檗碱)、29.02%(脱水穿心莲内酯)、16.84%(藁本内酯),提示在实际生产过程中,要注意控制小檗碱、药根碱等含量变化。从COX-2抑制的抗炎生物活性来看,藁本内酯、巴马汀与抗炎活性之间存在着显著的相关性,说明藁本内酯和巴马汀含量越高,对COX-2酶活性对的抑制活性也性高。提示藁本内酯和巴马汀可能是FKQJ发挥抗炎作用的有效成分,在实际生产的质量控制中,应增加对这类化学成分的检测,从而确保质量的一致性和稳定性,更好的助力FKQJ的质量控制。为了弥补单一质量指标性成分对的整体质量控制方面的不足,开展关联临床疗效和作用机制的生物评估方法的研究,拟定了质量标准。综上所述,本文以FKQJ的抗炎活性为出发点,探讨建立与临床疗效和作用机制有关的中药质量生物学评价方法,找出有效成分和指标,建立新的标准。该方法为中药复方制剂的质量控制和评价提供了新的思路和技术参考。由于时间和精力有限,FKQJ质量生物学评价方法和标准仍然不够,研究团队将进一步验证和优化。