葡萄(Vitis viniferq L.)是世界上种植最广,经济效益最高的果树之一。然而非生物胁迫是影响其生长发育和产量的重要环境因素,而其中又以干旱和盐渍的影响最为严重。促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)级联途径是真核生物中广泛存在的信号转导途径,并在植物应对各种生物和非生物胁迫,激素以及在细胞分裂和发育过程中起关键作用。目前,尽管在植物中发现了大量的MAPK,但关于葡萄中MAPKKK、MAPKK和MAPK基因家族的研究还是很少。葡萄基因组测序完成,为在基因组水平上解析葡萄MAPK级联途径各激酶基因家族的功能成为可能。本研究根据植物MAPKKK、MAPKK和MAPK基因的保守特性首次系统地鉴定了葡萄中这三个家族的基因,包括基因的分类、蛋白特性、基因结构、染色体分布、系统进化关系。同时也分析了它们在葡萄不同组织和发育阶段中的表达情况以及在不同胁迫和激素处理下的表达模式。在此基础上进而对VvMKK2, VvMKK4和VvMPK6基因功能进行了研究。主要结果如下：本研究从葡萄基因组中鉴定和分析了45个MAPKKK基因。进化树分析将其分为3个亚家族,分别命名为MEKK、ZIK和RAF,这与保守结构域和基因结构分析相一致。Microarray和实时荧光定量PCR结果发现jMAPKKK基因在特定的组织中均有表达,并且在不同花发育阶段表现出不同的表达特征。四个基因(VvMAPKKK14, 15, 31和33)在雄蕊和花粉中有较高的表达,VvMAPKKK18在茎和根中特异性表达。对葡萄幼苗进行白粉病、干旱和水杨酸、乙烯(ethylene)、过氧化氢处理,提取叶片总RNA进行qRT-PCR分析表明,葡萄中的MAPKKKs响应生物、非生物胁迫以及植物激素的处理,预测部分基因在胁迫中发挥重要作用。从葡萄基因组中鉴定出5个MAPKK成员,分别命名为VvMKK1-VvMKK5,并通过克隆得到验证它们的存在。序列分析发现这些基因的ORF长度为945-1557bp,编码314-518个氨基酸。氨基酸序列比对发现它们与拟南芥的同源基因具有高度一致性,而且这5个VvMKK蛋白均含有所有植物MAPKK的保守氨基酸亚区以及磷酸化序列S/TxxxxxS/T,并被分为四个亚族。荧光定量PCR技术分析MAPKK基因在葡萄不同组织中的表达表明,VvMKK1, VvMKK2, VvMKK4和VvMKK5基因在老叶,幼叶和根中上调表达,但是在叶柄中的表达量相对低。当葡萄受到胁迫诱导后,VvMKK2, VvMKK3和VvMKK4表现出差异性上调,表明这些基因可能实现不同的功能并参与不同的信号通路。从测序葡萄基因组中鉴定和注释了12个VvMAPKs基因,并通过PCR克隆和3RACE技术进行验证。序列分析发现这些基因的ORF长度为1107-1842 bp,编码368-613个氨基酸。氨基酸序列比对发现它们与拟南芥具有高度一致性,而且这些基因编码的蛋白质具有MAPK保守的11个结构亚区和T-X-Y特征磷酸化位点。基因结构和进化树分析表明它们可以分为4个亚族,即A、B、C和D亚族,而且位于同亚族的基因有相似的外显子/内含子结构。实时荧光定量PCR技术分析表明MAPKs基因在葡萄不同组织及生长发育过程中的表达模式不同。VvMPK1和VvMPK10基因的表达变化明显。其中VvMPK1基因在雄蕊和花粉中高表达,而且其转录水平在浆果采后的枯萎期逐渐增加。VvMPK10基因在所有的花器官中都高表达,尤其是在花粉中,但在果实发育和采后的后期表达量偏低。其他一些VvMPKs(VvMPK4, 6和11)在某些特定的器官或阶段低表达：VvMPK4基因在衰老叶片和冬芽中表达量很低,]VvMPK6基因在茎中高表达,但是在花器官,花芽和种子中低表达,而VvMPK11基因在成熟、采后的浆果和衰老叶片中表达量偏低。上述结果表明,MPK家族成员与葡萄的组织与生长发育密切相关。然后利用实时荧光定量PCR技术分析白粉病、干旱和水杨酸、乙烯和过氧化氢处理葡萄叶片中VvMPK基因的表达模式。结果发现,在白粉病侵染后,VvMPK5和VvMPK6基因下调表达,VvMPK1和VvMPK10基因分别被侵染48小时和12小时后表现出显著上调表达,而VvMPK9基因的表达量随着时间而增加。在干旱胁迫下,所有VvMPK基因都上调表达。在SA处理下,VvMPK6基因和VvMPK7基因分别在处理后4小时和12小时后,表达量增加了3倍多。其余VvMPKs在响应SA时下调表达。ETH处理条件下,多数VvMPKs基因与对照相比表现出显著的差异。H2O2处理下,几乎所有的VvMPK基因表达量没有明显变化,除了VvMPK1和VvMPK8都在48小时后被诱导高表达,表达量都达到了初始表达量的2.5倍以上。进一步研究了VvMKK2, VvMKK4和VvMPK6基因在信号转导过程中的具体功能。本研究构建这些基因的植物表达载体并转化拟南芥。用GUS染色和PCR的方法进而证明获得了过表达VvMKK2/VvMKK4/ VvMPK6基因的转基因拟南芥植株。对部分T3代纯合阳性转基因株系及野生型拟南芥分析表明,在正常MS培养基上,过量表达的拟南芥和野生型的萌发率没有明显差别。虽然ABA可以抑制转基因和野生型拟南芥种子的萌发,但对转基因拟南芥的抑制明显强于野生型。在高盐处理后,过量表达VvMKK2和VvMPK6基因的转基因拟南芥种子比野生型种子的萌发率高,幼苗的生长也比野生型拟南芥幼苗好。同样,干旱胁迫后,过量表达VvMKK2和VvMPK6基因的转基因拟南芥种子比野生型拟南芥种子的萌发率高,幼苗的生长也比野生型拟南芥幼苗好,而且植株比野生型植株的存活率高。在高盐和干旱条件下,转基因植株的抗氧化酶的活性明显高于野生型植株,丙二醛(MDA)积累量较野生型少,表明过表达VvMKK2/VvMKK4/VvMPK6的转基因拟南芥的抗氧化能力得到改善。以上结果都表明VvMKK2/VvMKK4/VvMPK6基因在拟南芥中的过量表达提高了植株的抗盐和干旱胁迫的能力。