目的:利用CRISPR/Cas9技术,针对HGPRT目的基因设计打靶sgRNA,进行基因敲除并通过筛选单克隆技术等从而获得HGPRT基因缺陷型细胞株,为制备兔抗单克隆抗体打下良好基础。方法:利用GenBank找出HGPRT基因组的外显子区域。利用在线网站,输入第一个和最长的外显子序列作为靶序列,设计sgRNA,选出并筛选最优序列。构建CRISPER/Cas9重组真核质粒,利用慢病毒包装技术,通过293T细胞包装得到靶向兔HGPRT基因的病毒株。再利用构建的重组质粒包装获得的慢病毒侵染兔骨髓瘤细胞,通过药物Puromycin、6-TG和HAT选择培养基筛选,有限稀释法单克隆技术,获得的中靶阳性细胞克隆—HGPRT基因缺陷型的兔骨髓瘤细胞。结果:1、设计相对应的sgRNA,通过测序的方法验证了成功构建具有兔HGPRT基因敲除序列的CRISPR/Cas9重组质粒。2、利用重组质粒lentiCRISPR v2,包装辅助质粒psPAX2和pMD2.G三种质粒共同转染HEK293T细胞后,包装出具有基因敲除能力的慢病毒株。3、通过用浓缩的重组慢病毒侵染生长状况较好的对数生长期兔骨髓瘤细胞,分别用0.8μg/mL的Puromycin,梯度浓度的6-TG(6-疏基鸟嘌呤)进行加药筛选后再通过HAT选择培养基进行验证。通过有限稀释单克隆法分离得出中靶阳性单克隆细胞。4、将实验组的细胞扩培后提取DNA进行T7E1酶切验证,以及直接测序两种方法鉴定,成功筛选到HGPRT基因缺陷型单克隆细胞。结论:本课题通过CRISPER/Cas9技术,成功构建靶向敲除兔HGPRT基因的lentiCRISPR v2重组质粒,并包装浓缩出具有敲除HGPRT基因的慢病毒株,通过侵染后一系列的筛选和验证手段,建立了兔骨髓瘤HGPRT基因缺陷型细胞。该基因改造缺陷型细胞,为后续的兔抗单克隆细胞杂交实验打下了基础。