目的:　　子宫内膜异位症(Endometriosis，EMs，简称内异症)是普通妇科领域最受关注的疾病，虽然内异症以生育年龄女性为高发人群，而且不孕、疼痛、盆腔包块为主要临床特点，但内异症恶变始终是内异症研究的热点问题。内异症恶变率为0.7％～1.5％[1]。近年，内异症的发生率不断增高，其恶变的病例数也在逐年增加。内异症恶变最多见于卵巢，占内异症恶变的76％，主要病理类型为内膜样癌和透明细胞癌。卵巢外的内异症恶变可见于肠道、盆腔、阴道直肠膈、阴道及剖宫产瘢痕等处，病理类型以异位腺上皮细胞恶变为腺癌为主[2]。　　子宫内膜异位症恶变系统科学研究的基础研究条件成为阻碍研究进展的重要因素，细胞模型建立、动物模型建立报道都较罕见。转基因诱发的靶向动物模型最具备研究价值，但前提是疾病的致病靶基因相对明确，内异症恶变靶基因研究尚为空白。而内异症恶变移植动物模型的建立因大样本恶变标本及细胞模型的缺乏而难以实现，诱导内异症移植动物模型恶变存在异种排斥等干扰因素，结论科学性受到质疑。有效的诱导内异症恶变也许是突破研究障碍的重要途径之一。　　在内异症恶变临床高危因素中，高雌激素居首，局部高雌激素刺激导致内异症异位内膜过度生长，可能与内异症恶变相关[3,4]。此外，糖尿病与子宫内膜癌、乳腺癌等多种癌症的发生密切相关[5]。高血糖为快速增殖的癌细胞提供丰富的营养环境，使其比正常细胞具有更强的代谢和消耗葡萄糖的能力[6]，间接促进高雌激素对异位内膜细胞的刺激作用。因此，高血糖可能成为内异症恶变的“催化剂”，加速良性异位内膜细胞恶变。手术诱导的大鼠自体内异症模型广泛应用于基础及临床研究[7]。大鼠异位种植内膜与人类内异症有很多相似之处:异位内膜生长方式，雌激素敏感性，病灶及腹腔液中异常细胞因子表达，以及临床表现，例如:不孕[8]和盆腔疼痛等[9]。因此，大鼠内异症自体模型适合作为诱导内异症恶变载体。　　内异症恶变的发生和发展是一个多基因、多步骤的过程。近年来表观遗传学机制与肿瘤发生、发展的关系是广大学者研究的热点，其中DNA甲基化是表观遗传学上研究最深入的一种机制。DNA甲基化是指额外的甲基通过DNA甲基转移酶调节，链接到CpG岛中胞嘧啶5＇碳末端，CpG岛发生异常甲基化常见于基因启动子区域[10]。基因启动子区域甲基化是导致基因沉默的一种重要表观遗传机制[10,11]，能够通过抑制基因表达进而使调节DNA修复、细胞周期、凋亡、细胞粘附和解毒等相关的细胞通路失活，使细胞无限增殖，最终导致肿瘤的发生[12，13]。RASSF2基因是本课题组通过甲基化CpG岛富集结合代表性差异分析(MCA-RDA)技术筛查出的卵巢内异症恶变组织相对正常卵巢组织的差异甲基化基因。RASSF2基因包含11个外显子，定位于染色体20p13，跨度约43kb，具有3个转录本:RASSF2A、RASSF2B和RASSF2C，仅RASSF2A在转录起始部位-105bp到+1075bp间具有一个CpG岛结构。RASSF2蛋白并不具有酶活性或者DNA结合能力，但可以通过与其他凋亡前因子及肿瘤抑制因子相互作用激活，如:PAR-4和MST1/2[14,15]。因此，RASSF2同时也可调节这些因子所控制的信号通路。研究表明，RASSF2基因过表达可促进凋亡及细胞周期阻滞，抑制肿瘤细胞生长[16]。相反，RASSF2表达缺失可导致细胞过度生长、恶变及肿瘤转移[17-19]。因此，RASSF2基因被认为是一种抑癌基因。RASSF2甲基化见于多种类型肿瘤[20,21]。本课题组前期研究表明RASSF2基因的表观失活与卵巢内异症恶变相关，参与了异位内膜向卵巢癌的恶变过程，可能是内异症恶变过程的晚期事件[22]。因此，RASSF2基因过甲基化与内异症恶变的更深入机制值得探讨。　　本研究在本课题组前期研究的基础上，通过甲基化寡核苷酸技术靶向诱导内异症患者在位子宫内膜细胞中RASSF2基因甲基化，研究RASSF2基因甲基化对子宫内膜细胞的影响。利用技术成熟的大鼠内异症自体模型，通过链脲霉素与高糖高脂饮食共同诱导发生糖尿病，并给予高雌激素刺激，诱导大鼠内异症恶变，进一步明确RASSF2基因与内异症恶变相关性。　　方法:　　一、高雌激素和高血糖诱导大鼠内异症自体模型恶变及其生物学特征研究　　1、建立大鼠腹膜子宫内膜异位症模型;　　2、高糖高脂饮食、链脲霉素及高雌激素诱导大鼠内异症恶变;　　3、光镜，电镜观察异位内膜组织显微及亚显微结构;　　4、免疫组化检测大鼠异位及在位内膜组织中PTEN、p-AKT和p-mTOR的表达情况;　　5、增殖、凋亡检测异位组织生物活性。　　二、在位子宫内膜细胞RASSF2基因甲基化在子宫内膜异位症恶变中的作用及意义　　1、原代培养内异症患者在位内膜上皮和间质细胞;　　2、免疫细胞化学染色鉴定细胞;　　3、建立RASSF2甲基化(methylated oligonucleotide，MON)及非甲基化(non-methylated oligonucleotide，NON)细胞模型;　　4、甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR，MSP)技术检测RASSF2在细胞模型中的甲基化情况;　　5、蛋白免疫印迹技术(Western blotting)检测RASSF2蛋白表达情况;　　6、MTT细胞增殖实验检测转染MON及NON后各组细胞增殖能力的改变;　　7、应用Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒检测RASSF2基因发生甲基化前后各组细胞凋亡率的改变;　　8、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测RASSF2基因发生甲基化前后MMP-9，VEGF在培养上清中的含量变化;　　9、高雌激素及高血糖诱导大鼠内异症恶变;　　10、甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR，MSP)技术检测RASSF2在异位及在位组织中的甲基化情况;　　11、蛋白免疫印迹技术(Western blotting)检测RASSF2在异位及在位组织中的蛋白表达情况。　　结果:　　一、高雌激素和高血糖诱导大鼠内异症自体模型恶变及其生物学特征研究　　1、90只实验大鼠中有10只于术后死亡，占11.1％。实验组与对照组异位病灶全部形成;　　2、实验组多数异位病灶随时间延长逐渐增大，而对照组病灶萎缩情况随时间延长明显增加。实验组在2、4、8个月异位病灶平均净重及平均体积明显高于相应月份对照组异位病灶(p＜0.05)。实验组中，可见2例明显增大的异位病灶，囊壁增厚，内壁可见乳头样增生。其余异位病灶呈现囊性，伴有囊壁不同程度增厚，囊液不同程度浑浊，可见血性或脓性囊液;　　3、光镜下，实验组中，2例明显增生的异位病灶表现为子宫内膜样癌，其对应在位内膜组织均为不典型增生改变(4.0％);3例异位病灶不典型性增生，对应在位内膜组织均为单纯增生样改变(6.0％)。透射电镜可见:恶变细胞呈现明显细胞形态的异常，可见线粒体肿胀及空泡样改变。此外，与4个月单纯性增生相比，8个月单纯性增生异位内膜细胞呈现增大的细胞核，细胞质减少，表现出更活跃的细胞状态;　　4、在恶变、不典型性增生在位及异位内膜中，与对照组异位内膜相比，p-AKT及p-mTOR染色H-score值逐渐增加，有统计学差异(p＜0.05); PTEN染色H-score值逐渐降低，有统计学差异(p＜0.05)。相同病理类型内膜组织上述基因无统计学差异(p＞0.05);　　5、增殖实验显示:实验组中，与良性和不典型增生异位内膜相比，恶变的异位内膜增殖染色H-score值明显增加(p＜0.05);凋亡实验显示:与良性和不典型增生异位内膜相比，恶变的异位内膜凋亡染色H-score值明显减少(p＜0.05)。雌激素组良性异位内膜组织增殖染色H-score值高于对照组良性异位内膜组织(p＜0.05);凋亡染色强度低于对照组良性异位内膜组织(p＜0.05)。　　二、诱导在位子宫内膜细胞中RASSF2基因甲基化及其分子生物学研究　　1、体外成功分离和共培养子宫内膜异位症在位内膜上皮和间质细胞(EC);　　2、免疫细胞化学染色鉴定结果表明，角蛋白染色阳性，CD10染色阴性，波形蛋白染色阴性，证实为子宫内膜上皮细胞;角蛋白染色阴性，CD10染色阳性，波形蛋白染色阳性，证实为子宫内膜间质细胞;　　3、构建两个甲基化细胞模型（MON1组及MON2组），一个非甲基化细胞模型(NON组)，未转染寡核苷酸的对照组（EC组）;　　4、MSP结果显示:MON1组及MON2组内膜细胞均发生RASSF2基因甲基化，NON组未检测到该基因发生甲基化;　　5、蛋白免疫印迹结果显示:MON1组及MON2组RASSF2蛋白表达水平均低于NON组，有统计学意义(p＜0.05)。MON1组及MON2组RASSF2蛋白表达水平无统计学差异(p＞0.05)，NON组及EC组无差异(p＞0.05);　　6、MTT细胞增殖实验结果显示:MON1组及MON2组在24h，48h和72h细胞增殖能力明显高于相应NON组(p＜0.05)。其中，MON1及MON2组在72hEC增殖能力低于48h(p＜0.05)。NON组细胞增殖能力与EC组无显著统计学差异(p＞0.05);　　7、凋亡检测结果显示:RASSF2发生甲基化后EC即转染MON1及MON2后凋亡率明显降低，与RASSF2未发生甲基化的NON组比较，p＜0.05。EC转染NON组细胞凋亡率与EC组相比，差别无统计学意义，(p＞0.05);　　8、酶联免疫吸附试验结果表明:转染MON1后，EC分泌VEGF及MMP-9较转染NON组明显增加(p＜0.05)。转染MON2后，EC分泌VEGF及MMP-9较转染NON组明显增加(p＜0.05)。但MON1组及MON2组，EC分泌上述两种蛋白无统计学差异(p＞0.05)。转染NON组，EC分泌VEGF及MMP-9与EC组相比无统计学差异(p＞0.05)。　　9、MSP检测结果表明:恶变及不典型性增生异位内膜中RASSF2甲基化发生率高于良性异位内膜(p＜0.05)，恶变异位内膜中该基因的甲基化发生率高于不典型性增生异位内膜(p＜0.05)。异位内膜与在位内膜RASSF2甲基化率无统计学差异(p＞0.05)。　　10、Western blot结果显示:恶变异位内膜和不典型性增生异位内膜RASSF2蛋白相对表达水平分别为低于对照组异位内膜(p＜0.05)，恶变异位内膜RASSF2蛋白相对表达水平低于不典型性增生异位内膜(p＜0.05)。相同病理类型在位及异位组织RASSF2蛋白表达水平无统计学差异(p＞0.05)。　　结论:　　1、本研究诱导大鼠内异症恶变可模拟人类低级别子宫内膜样腺癌，方法简单可行，并为进一步探讨内异症恶变动物模型的建立，乃至为内异症恶变基础研究奠定基础。同时发现在位内膜与异位内膜对诱导因素具有相似反应，发生一致性病理异常增值改变，其中异位内膜更敏感、具有更高的恶变风险，提示在位内膜恶变与异位内膜恶变可能存在相似的遗传相关性。　　2、通过甲基化寡核苷酸技术特异性诱导内异症在位内膜细胞RASSF2基因甲基化，抑制该基因表达，导致内膜细胞增殖、侵袭能力增强，并抑制细胞凋亡，RASSF2基因甲基化可能通过阻断ras信号通路，改变子宫内膜细胞的生物学特性参与子宫内膜异位症恶变的发生。此外，RASSF2基因的表观失活与内异症恶变密切相关，可能参与了异位内膜向子宫内膜样腺癌的恶变过程，有望作为在位内膜候选靶基因之一为子宫内膜异位症恶变做出早期预测。