脑动脉重塑是高血压发展过程中引起脑卒中重要因素，血管重塑涉及到血管平滑肌细胞增殖、凋亡、炎症及纤维化等多重复杂的过程，其中动脉血管平滑肌细胞增生和肥大被认为是动脉血管重塑的最重要特征，其表现为血管平滑肌细胞的数目增多以及细胞体积的增大。因此研究引发脑动脉血管平滑肌增殖的机制是研究预防和治疗脑血管病变的一个重要环节。 ClC-3氯通道属于电压依赖性氯通道家族β亚族，ClC-3Cl-蛋白广泛分布与脑、肾脏、肺、整个脉管等组织器官。近来ClC-3Cl-蛋白在细胞增殖过程中的作用引起重视，我们实验室在大鼠主动脉平滑肌细胞的研究发现，ET-1能促进ClC-3蛋白的表达，这一作用与其促细胞增殖反应呈正相关性，而ClC-3反义寡核苷酸可呈浓度依赖性抑制ET-1引起的内源性ClC-3蛋白表达以及3H-胸腺嘧啶掺入，二者存在相关性。说明ClC-3通道参与了血管平滑肌细胞增殖过程。ET-1和其他血管活性因子可促进肺动脉平滑肌细胞的ClC-3mRNA的表达，同时ClC-3蛋白能被生长因子上调也在前列腺癌细胞系以及淋巴细胞上得到证实，在体研究方面我们实验室在两肾两夹的肾性高血压的大鼠模型中发现，随着血压的增加，基底动脉血管平滑肌细胞容积增大，低渗诱导氯通道开放增强导致细胞内氯外流增加，与此同时脑基底动脉平滑肌表达ClC-3蛋白表达增加。ClC-3也被报道参与肺动脉高压引起的右心室重塑，这些资料说明ClC-3氯通道介导的氯运动参与细胞增殖等容量的变化相关的病理生理过程。 本课题拟在回答三方面问题：1)ClC-3氯通道是否参与脑基底动脉平滑肌细胞的增殖?2)ClC-3氯通道对细胞周期进程如何影响，是否调节细胞周期相关蛋白，以及影响哪些细胞周期相关的信号通路?如何影响?3)直接激活VRCC对细胞增殖和细胞周期的影响，由哪些信号介导?ClC-3氯通道在VRCC调节细胞增殖中的作用。 第一部分ClC-3氯通道蛋白在大鼠脑基底动脉平滑肌细胞增殖中的作用 1.StealthsiRNA对基底动脉血管平滑肌细胞内源性及ET-1诱导的ClC-3蛋白表达的作用 Westernblot分析表明大鼠脑基底动脉血管平滑肌细胞上有内源性ClC-3氯通道蛋白表达，分子量为80-100kDa。10nmol·L-1ET-1处理48小时后ClC-3蛋白表达增加到比未给ET-1刺激的对照组的2.05±0.21倍。 为了沉默ClC-3蛋白表达，我们设计了三对StealthsiRNA片断分别转染入脑基底动脉血管平滑肌细胞。 2.沉默ClC-3蛋白对基底动脉血管平滑肌细胞增殖的影响 用细胞计数和MTT(WST-8新一代MTT)试验分析细胞增殖。MTT分析细胞增殖试验结果表明：同对照组相比，基底动脉平滑肌细胞MTT的代谢率在ET-1处理组、ET-1+lipofectamine处理组、ET-1+negativesiRNA处理组、ET-1+ClC-3siRNA处理组分别增加1.54±0.17、1.52±0.12、1.51±0.18倍及1.09±1.10倍，siRNA沉默ClC-3蛋白表达后ET-1诱导的细胞数目增加以及MTT代谢增加分别被抑制。 3.过表达ClC-3蛋白对细胞增殖的影响 将ClC-3全长质粒载体转入基底动脉平滑肌细胞可明显增加ClC-3蛋白表达。转染后细胞增殖实验表明：iipofectamine对照组、pcDNA3.1质粒对照处理组、ET-1+pcDNA3.1质粒处理组，ET-1+CIC-3pcDNA处理组中细胞的MTT代谢率分别为空白对照组的0.95±0.07、1.01±0.1、1.45±0.08倍、1.75±0.07倍，表明外源性转染全长ClC-3cDNA后使之过表达后可加快ET-1诱导的基底动脉平滑肌细胞增殖的速度。 小结： 1)大鼠脑基底动脉平滑肌细胞上有内源性ClC-3氯通道蛋白表达，分子量80-100KD，ET-1可诱导ClC-3氯通道蛋白表达。 2)沉默ClC-3氯通道抑制ET-1诱导的基底动脉平滑肌细胞增殖。 3)ClC-3过表达加快ET-1诱导的基底动脉平滑肌细胞增殖。 以上结果提示ClC-3氯通道可促进基底动脉平滑肌细胞增殖。 第二部分沉默ClC-3对细胞周期的影响以及相关机制。 1.沉默ClC-3蛋白对基底动脉血管平滑肌细胞周期的影响 流式细胞仪分析细胞周期结果显示：siRNA沉默ClC-3表达后G0/G1期的细胞数目比例从62.67±2.90％增加到78.87±4.36％，与之对应S期的细胞数目比例从32.68±3.64％下降到17.04±2.17％。 2.沉默ClC-3蛋白对细胞周期调控蛋白的影响 同空白对照组相比，基底动脉平滑肌细胞cyclinD1的表达在ET-1处理组、ET-1+lipofectamine处理组、ET-1+negativesiRNA处理组、ET-1+ClC-3siRNA处理组分别增加，表明ET-1能明显增加细胞的cyclinD1的表达，ClC-3被沉默后，ET-1的这个效应明显受到抑制。 同空白对照组相比，基底动脉平滑肌细胞cyclinE表达在ET-1处理组、ET-1+lipofectamine处理组、ET-1+negativesiRNA处理组、ET-1+ClC-3siRNA处理组分别增加，表明ET-1能明显增加细胞的cyclinE的表达，如果ClC-3被沉默ET-1的这个效应受到抑制。 与空白对照组相比，基底动脉平滑肌细胞P21，P27的表达在ET-1处理组分别减少，表明ET-1能明显抑制P21，P27的表达，沉默ClC-3可以逆转ET-1对这两个蛋白表达的影响。 3.沉默ClC-3蛋白对细胞周期调控相关信号通路的影响 为了进一步分析沉默ClC-3表达后对细胞周期影响的原因，我们检查与血管平滑肌细胞周期G1/S转换调控相关的磷酸化信号通路，结果表明同对照组相比，ET-1能诱导基底动脉平滑肌细胞ERK1/2的磷酸化，10min就有明显增加，1小时后达到高峰，随后磷酸化水平下降，12小时后下降到接近基础水平，当ClC-3表达沉默后，ET-1也能诱导ERK1/2的磷酸化但是其程度明显比未沉默组明显减弱。 小结： 1)沉默ClC-3氯通道阻止大鼠基底动脉平滑肌细胞周期从G0/G1期进入S期，阻止DNA的合成。说明ClC-3氯通道参与基底动脉平滑肌细胞周期G1/S转换的调节。 2)沉默ClC-3抑制细胞周期调控蛋白cyclinD1和cyclinE表达，增加P21，P27表达。 3)沉默ClC-3抑制ERK1/2的磷酸化，沉默ClC-3抑制Akt308、473位点和GSK3β的ser9位点磷酸化。说明ClC-3通过这些磷酸化信号通路影响细胞周期G1/S转换。 第三部分ClC-3通道在低渗激活VRCC后引起细胞增殖中的作用及机制 1.低渗激活VRCC对细胞增殖和细胞周期的影响及ClC-3蛋白在该过程中的作用 流式细胞仪分析细胞周期发现基底动脉平滑肌细胞G0/G1期的细胞数目比例在等渗对照组、低渗培养处理组、低渗+negativesiRNA处理组、低渗+ClC-3siRNA处理组处于S期的细胞数目比例在分别在等渗对照组、低渗培养处理组、低渗+negativesiRNA处理组、低渗+ClC-3siRNA处理组分别为11.24±3.92％、30.14±5.48％、31.43±5.12％、12.31±5.09％。siRNA沉默ClC-3表达后G0/G1期的细胞数目比例从62.61±4.3％增加到78.94±3.91％而与之相反S期的细胞比例从30.14±5.49％下降到12.31±5.09％。进一步通过BrdU试验观察ClC-3沉默后对DNA掺入的影响，同等渗对照组相比，基底动脉平滑肌细胞BrdU掺入率在低渗培养处理组、低渗+negativesiRNA处理组、低渗+ClC-3siRNA处理组分别增加。 2.低渗对细胞容积的影响以及ClC-3的作用 通过检测细胞的电容来观察细胞的容积变化在细胞增殖中的作用，结果表明：等渗对照组的电容为37.28±1.31pF，低渗处理可使细胞容积增加，膜电容增加到48.56±2.08pF，沉默ClC-3后低渗能诱导细胞电容增加到40.44±2.52pF，但是增加幅度远较未沉默组小。 3.低渗对增殖相关信号通路的影响以及ClC-3在这个过程中的作用 为了进一步观察沉默ClC-3表达的作用，我们检查与细胞周期G1/S转换点相关的信号通路，结果表明同对照组相比，低渗处理1小时能引起基底动脉平滑肌细胞ERK1/2磷酸化，当ClC-3表达被沉默后，低渗诱导ERK1/2的磷酸化程度明显比未沉默组减弱。 1)低渗直接激活VRCC诱导大鼠基底动脉平滑肌细胞增殖且促进细胞周期从G0/G1进入S期，沉默ClC-3抑制细胞增殖并阻滞细胞周期在G1/S限制点。 2)沉默ClC-3蛋白抑制细胞周期进程中低渗诱导的细胞容积增加。 3)激活VRCC可诱导ERK1/2及Akt在473位点磷酸化。ClC-3沉默后低渗诱导这些磷酸化的效应被抑制。 以上说明VRCC通过ERK1/2和Akt磷酸化信号诱导基底动脉平滑肌细胞增殖和细胞周期G1/s转换。其中，细胞容量增加是这个转换过程中必不可少的因素。