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目的
探讨小白菊内酯(Parthcnolide,PTL)对人神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)细胞株SK-N-SH细胞凋亡的影响以及可能的作用机制。
方法
一、细胞培养及实验分组
人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞于含10%小牛血清、100u/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养液中,在37℃、含5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养,每2～3d传代1次。设置10μmol/L及15μmol/L两个药物剂量组,另设阴性对照组。
二、MTT法检测细胞活性
取对数生长期细胞的SK-N-SH细胞,调细胞密度为1×104个/mL细胞悬液,接种于96孔板,对照组及各药物处理组均做4个复孔,常规培养48h后每孔加入新鲜配制的MTT,继续孵育4h,弃培养基,每孔加入DMSO溶液150μL,震荡10min,酶标仪(波长490nm)测定吸光度(A)。抑制率(%)=[(对照组平均A值-实验组平均A值)/对照平均A值]×100%。
三、倒置显微镜观察细胞形态学变化
取对数生长期的SK-N-SH细胞,配制成1×104个/mL细胞悬液,每孔1mL细胞悬液接种到6孔板中,24h后换含不同浓度PTL(0、10、15μmol/L)的培养液培养48h,倒置显微镜下观察细胞形态学变化。
四、AnnexinV/PI复染流式细胞术检测细胞凋亡率
待测细胞中加入AnnexinV-FITC和PI,避光反应15min后上机分析,流式细胞仪激发波长为488nm。在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限为正常细胞(AnnexinV-/PI-):右上象限为坏死细胞(AnnexinV+/PI+);右下象限为凋亡细胞(AnnexinV+/PI-)。
五、WesternBlot分析凋亡相关蛋白Bcl2、Bax、Pro-caspase-3、Caspase-9及NF-KBp65的表达
收集经过不同处理的细胞标本,使用细胞裂解液制备细胞总蛋白(NF-κBp65抽提核蛋白),分析蛋白浓度。取等量蛋白上样进行SDS-PAGE凝胶电泳,转膜过夜,5%脱脂牛奶室温封闭1h,加入一抗4℃过夜,之后加入二抗室温孵育1h,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后,加入显影剂,暗室显影。
六、统计方法
所有指标均以均值士标准差(-x±s)表示。用SPSS17.0软件进行方差分析和各组间差异的比较。检验水准α=0.05。
结果
1、PTL对SK-N-SH细胞具有增殖抑制作用,其抑制作用在一定浓度范围内呈剂量依赖性。在30μmol/L时抑制作用最强,再增加PTL浓度(50μmol/L),抑制率增加不显著(P=0.341)。
2、显微镜下观察对照组细胞生长良好,成多边形,核质清晰;PTL作用48h后,10μmol/L组细胞数量减少,部分细胞变圆;15μmol/L组细胞数量明显减少,细胞固缩呈圆形,单个散在存在,少量细胞溶解。
3、对照组、10μmol/L及15μmol/L作用于SK-N-SH细胞24h后的凋亡率分别为0.66±0.15%、13.00±1.31%、20.83±1.11%,各组数据比较差异有统计学意义(P＜0.01)。
4、WesternBlot结果显示PTL可下调Bcl-2及Pro-caspase-3的表达,并上调Bax及Caspase-9的表达。
5、WesternBlot结果显示PTL可抑制NF-κBp65的表达。
结论
1、小白菊内酯可抑制SK-N-SH细胞增殖并诱导其凋亡;
2、小白菊内酯的促凋亡作用与凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax失衡有关;
3、小白菊内酯可诱发Caspase级联反应从而引起SK-N-SH细胞凋亡;
4、小白菊内酯的促凋亡的作用机制可能与抑制NF-κB信号通路有关。