产琼胶酶菌株的筛选及其酶学性质

来源 :福建农林大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:heguojing514
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本文从厦门近海海域水样中筛选分离得到一株高产琼胶酶能力的菌株,并进行菌株鉴定,发酵工艺参数和酶解条件优化,通过薄层色谱层析和液相色谱-质谱联用仪分析鉴定酶解产物组成,并对酶解产物的生物活性进行探究,分述如下:1)分离获得8株具有琼胶降解活性的菌株,其中fst-13007酶活力最高(保藏编号CCTCC NO:M 2013708),对其16S rDNA经过BLAST序列比对和系统进化发育树分析,鉴定为海旋菌(Thalassospira)属,将其命名为Thalassospira sp.fst-13007。2)通过正交实验获得菌株fst-13007的摇床-三角瓶环境的适宜发酵条件为:温度35℃、三角瓶装液量70 ml/250 ml、摇床转速200 rpm、NaCl浓度3%、初始pH 8.0、接种量8%、琼脂粉浓度0.8%、蛋白胨+酵母粉(0.5+0.1)%(w/v)。在此发酵条件下,酶活达到最大2.76 U/ml,是未优化时的3.4倍。3)对fst-13007所产的琼胶酶通过一系列手段进行分离纯化,包括硫酸铵分级盐析,切向超滤过滤,DEAE-Sepharose Fast Flow柱进行离子交换层析与和Sephcryl S-100进行凝胶色谱柱层析,获得纯的琼胶酶,纯化倍数18.97,收率13.87%,比活力1418U/mg,相对分子量约66.2 KDa。4)对琼胶酶aga-fst的酶学性质研究结果表明:底物浓度为0.5%,最适反应温度为45℃,最适pH为8;在20-50℃和pH 4-8具有较稳定的酶活。Cu2+,Fe3+对该琼胶酶有强抑制,Mn2+,DTT有促进酶活力提高的作用;Ca2+、Na+、Mg2+、K+、SDS和EDTA对酶活均有一定的抑制作用。5)通过蛋白质谱MALDI-TOF-TOF分析表明琼胶酶aga-fst与β-琼胶酶(AAA91888)具有显著的同源性。可初步推测琼胶酶aga-fst为一种新型的GH16超级水解家族的β-琼胶酶。通过对底物特异性的实验后证明琼胶酶aga-fst为内切型的p-琼胶酶。6)通过薄层色谱层析和液相色谱-质谱联用仪对酶解产物鉴定,分析的结果表明酶解产物包含40%新琼二糖,53%新琼四糖和7%新琼六糖。琼胶寡糖体外清除DPPH自由基的实验显示较好的抗氧化效果。
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