启动子是基因表达调控的重要元件。在转基因植物中,启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一,选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的关键。泛素启动子以其启动效率高、甲基化程度相对较低、遗传性状稳定等特点而成为目前研究较多的启动子之一。在植物基因工程中,通过构建由该类启动子驱动的外源基因高效表达载体,可获得高水平的表达系统,为作物转基因工程提供新的手段和思路。因而,克隆和开发利用新的泛素类新启动子在转基因植物中有重要的理论意义和重大的应用前景。鉴于此,本研究以克隆新的泛素类基因启动子为目的,通过从Genbank中筛选部分不同物种中的泛素延伸蛋白类基因序列,如花生(Arachis hypogaea)、烟草(Nicotiana tabacum)、蕃茄(Solanum lycopersicum)、甜椒(Capsicum annuum)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)、水稻(Oryza sativa)等。根据这些序列同源性区域设计嵌套引物,利用锚定PCR法扩增得到菊花(Dendranthema grandiflora)泛素延伸蛋白基因起始密码子上游1472 bp启动子序列,命名为DgUEP(Genbank登录号为EU862325)。利用生物信息学预测获得的菊花泛素延伸蛋白基因启动子的基础启动子和转录起始位点。结果显示在-1286 bp～-1236 bp、-318 bp～-268 bp和-98 bp～-48 bp的位置存在基础启动子序列,其可能性分别为0.93、0.93和0.95。其中,后两个基础肩动子区相邻较近。DgUEP肩动子除了具备肩动子的基本元件和一些光应答顺式作用元件外(如TATA-box、CAAT-box、G-Box、GAG-motif、GATA-motif等),还含有一些花特异性表达的顺式作用元件,如anther box like、TACPyAT-box、POLLENlLELAT52、P-box等。将DgUEP启动子目的序列定向替换植物双元表达载体pBI121中的35S启动子,并将其与GUS报告基因融合;通过农杆菌转化法在烟草叶片和菊花花瓣中进行瞬时表达。结果表明,该启动子能驱动GUS基因在烟草叶片和菊花花瓣中表达,证明其具有启动子活性。结合生物信息学分析结果,根据DgUEP启动子中可能的转录起始位点和花特异性表达的顺式作用元件等特征,利用PCR介导技术分别对启动子进行了3’和5’端缺失突变,并将各突变体在烟草叶片和菊花花瓣中进行瞬时表达分析。GUS活性分析发现3’端最小片段(-404bp～+4bp)和5’端最小片段(-1457bp～-1027bp)都具有转录活性,表明该启动子可能含有多个转录起始位点。GUS定量分析结果显示:该启动子主要转录起始位点可能位于翻译起始密码子ATG上游较远处(-1457bp～-1027bp);-1027bp～-604bp处可能存在着负调控元件,-1457bp～-1027bp片段间可能还存在增强元件;DgUEP启动子在花瓣中的活性明显高于叶片中的活性。结合生物信息学分析结果,本实验推测该启动子可能主要在花中表达。同时,还利用农杆菌介导法将含有DgUEP启动子不同缺失片段和GUS融合基因的表达载体转化烟草进行稳定表达,已得到转基因烟草阳性苗。