论文部分内容阅读
背景及目的胃癌是消化系统常见恶性肿瘤之一。目前,以手术为主的综合治疗方案对胃癌患者生存及预后的提高仍然有限,积极发掘胃癌发生发展的分子学机制和靶向治疗药物有利于突破治疗瓶颈。Trastuzumab,作为人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）抑制剂之一,是胃癌中最常见的靶向治疗药物,联合化疗可显著改善HER2阳性患者的总生存。但是,临床上胃癌患者HER2阳性率不及20%,这使Trastuzumab的受益群体更加局限。因此,发现调控胃癌增殖的新分子可为将来的靶向治疗提供更多的选择。不育α基序和含HD结构域蛋白1（sterile alpha motif and HD-domain-containing protein 1,SAMHD1）是重要的抗病毒分子,也与先天性的神经系统炎症性疾病—Aicardi-Goutières综合征有关。近期研究发现,SAMHD1参与调节肺癌和皮肤T细胞淋巴瘤发展。但是,SAMHD1对胃癌增殖是否有影响还不清楚。前期实验结果发现,胃癌组织中SAMHD1表达降低,与肿瘤大小、浸润深度以及TNM分期相关,提示SAMHD1低表达可能是胃癌发生发展的关键因素之一。本研究主要阐明SAMHD1对胃癌增殖的作用机制,探索Krüppel样因子4（Krüppel-like factor 4,KLF4）对SAMHD1基因的转录调控以及Thr592位点磷酸化修饰对SAMHD1抗胃癌作用的影响和机制。方法:1、通过免疫组化方法检测58例配对胃癌组织和癌旁正常黏膜组织中SAMHD1蛋白的表达水平,分析其表达与患者临床病理因素间的相关性。采用Western blot和q RT-PCR方法检测胃癌细胞（MKN-45、MGC-803、HGC-27和AGS）和胃正常黏膜上皮细胞中SAMHD1的蛋白和m RNA表达水平。2、在HGC-27和MGC-803细胞内,敲低SAMHD1表达后,采用CCK-8方法检测胃癌细胞增殖,采用平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;在MKN-45细胞内,过表达SAMHD1后,采用CCK-8方法检测细胞增殖,采用平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,采用流式细胞术分析细胞周期变化和DNA合成速度。在体内实验中,通过建立裸鼠皮下移植瘤模型,评估敲低SAMHD1表达对胃癌细胞瘤生长的影响。3、选用稳定敲低SAMHD1的HGC-27和稳定过表达SAMHD1的AGS细胞系进行转录组测序,使用生物信息学方法分析与SAMHD1表达相关的信号通路富集和差异表达基因集,采用q RT-PCR和Western blot方法检测胃癌细胞内丝裂原活化蛋白激酶6（mitogen-activated protein kinase kinase 6,MAP2K6）m RNA和蛋白表达以及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）p38信号通路活化水平。使用MAPK p38抑制剂SB203580处理胃癌细胞48 h,采用CCK-8方法检测细胞增殖,采用Western blot方法检测MAPK p38信号通路活化水平。4、双荧光素酶报告实验确定胃癌细胞中SAMHD1基因的核心启动子区。下载癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）和GSE54129数据库资料,分析胃癌组织中差异表达的转录因子集。使用UCSC和JASPAR网站,预测上述转录因子集中可与SAMHD1核心启动子区结合的转录因子。采用q RT-PCR和Western blot方法检测SAMHD1 m RNA和蛋白表达以及转录因子KLF4蛋白表达水平,并分析二者表达相关性。双荧光素酶报告实验和染色质免疫沉淀方法验证KLF4蛋白与SAMHD1核心启动子区结合。过表达KLF4后,采用q RT-PCR和Western blot方法检测SAMHD1的m RNA和蛋白表达。共转染sh KLF4（或sh NC）和p LVXSAMHD1（或p LVX-vector）质粒后,采用CCK-8检测细胞增殖。5、利用在线数据库q PTM,分析肿瘤中SAMHD1的翻译后修饰类型和磷酸化修饰的位点信息。采用免疫组化方法检测58例配对胃癌和癌旁正常黏膜组织中SAMHD1 Thr592位点磷酸化水平。在胃癌细胞中,转染p LVXSAMHD1-WT、-T592A、-T592E或-HD/AA质粒后,采用CCK-8检测细胞增殖。6、细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase,CDK）4/6抑制剂Palbociclib处理胃癌细胞后,采用CCK-8方法检测细胞增殖,采用Western blot方法检测CDK2、视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,Rb）和SAMHD1蛋白磷酸化水平。7、采用免疫共沉淀和质谱鉴定技术,分析HGC-27细胞中SAMHD1的互作蛋白谱,并与Hit Predict、Gene MANIA和Bio GRID数据库中SAMHD1互作蛋白谱取交集。采用免疫共沉淀和Western blot方法验证Nik相关蛋白激酶（Nik-related protein kinase,NRK）蛋白与SAMHD1蛋白互相作用。过表达NRK蛋白后,采用Western blot方法检测SAMHD1 Thr592位点磷酸化水平。结果:1、在胃癌组织及胃癌细胞系中,SAMHD1表达降低;SAMHD1表达与肿瘤大小、浸润深度以及TNM分期相关。这提示SAMHD1可能作为抑癌因子,参与调控胃癌增殖。2、在HGC-27和MGC-803细胞中,敲低SAMHD1表达促进细胞增殖和克隆形成;相反地,过表达SAMHD1抑制MKN-45细胞的增殖、克隆形成和DNA合成,并诱导细胞G1/G0期阻滞。在体内实验中,敲低SAMHD1表达促进裸鼠皮下移植瘤的生长。3、在稳定敲低SAMHD1表达的HGC-27细胞系中,差异表达基因集主要富集在MAPK信号通路;而在稳定过表达SAMHD1的AGS细胞系中,差异表达基因集主要富集在MAPK和PI3K/AKT信号通路;因此,MAPK通路是敲低或过表达SAMHD1的胃癌细胞系内共同富集到的信号通路。MAP2K6,作为MAPK p38信号通路的上游关键激酶之一,是最显著的差异表达基因。过表达SAMHD1降低AGS细胞内MAP2K6表达和MAPK p38蛋白磷酸化水平;相反地,敲低SAMHD1表达提高HGC-27细胞内MAP2K6表达和MAPK p38蛋白磷酸化水平。SB203580可以逆转敲低SAMHD1表达诱导的MAPK p38通路活化和细胞增殖加速。4、SAMHD1基因翻译起始位点前285 bp包含核心启动子区。在TCGA和GSE54129数据库中,胃癌组织中共有43个差异表达的转录因子。其中,KLF4是唯一能与SAMHD1核心启动子区结合的转录因子。胃癌细胞中SAMHD1 m RNA和蛋白表达水平与KLF4蛋白表达水平呈正相关。染色质免疫沉淀和双荧光素酶报告实验结果表明,KLF4蛋白可以结合至SAMHD1核心启动子区的特定序列,从而上调其转录活性。过表达KLF4可上调胃癌细胞中SAMHD1的m RNA和蛋白表达。下调KLF4表达可以促进AGS细胞增殖,这一过程可部分被过表达SAMHD1逆转。5、在q PTM数据库中,磷酸化修饰是肿瘤中SAMHD1蛋白最常见的翻译后修饰类型,Thr592是最常见的磷酸化修饰位点。58例胃癌组织中SAMHD1Thr592位点磷酸化水平高于癌旁正常黏膜组织。Thr592位点非磷酸化突变可以抑制胃癌细胞增殖,而Thr592位点拟磷酸化突变对胃癌细胞增殖没有影响,这表明Thr592位点磷酸化致使SAMHD1失去抑制胃癌细胞增殖的能力。6、Palbociclib可以通过剂量依赖性方式抑制SAMHD1 Thr592位点磷酸化,并增强SAMHD1的抗胃癌作用。7、对4个SAMHD1互作蛋白谱取交集,筛选出NRK蛋白。免疫共沉淀和Western blot实验证实NRK与SAMHD1蛋白互相作用。过表达NRK可以提高SAMHD1 Thr592位点磷酸化水平。结论:1、SAMHD1通过负向调控MAPK p38信号通路活化抑制胃癌细胞增殖。2、转录因子KLF4通过结合SAMHD1核心启动子区促进其转录;过表达SAMHD1可以抑制下调KLF4引起的胃癌细胞增殖。3、Thr592位点磷酸化致使SAMHD1失去抑制胃癌细胞增殖的能力,Palbociclib通过抑制Thr592位点磷酸化增强SAMHD1抗胃癌作用。4、NRK与SAMHD1蛋白互相作用,过表达NRK提高其Thr592位点磷酸化水平。