背景癫痫是一组由大脑神经元反复异常同步化放电所引起的短暂中枢神经系统功能失常为特征的慢性脑部疾病。1997年WHO统计报告,癫痫的患病率在发达国家、经济转轨国家、发展中国家和不发达国家分别为5.0‰、6.1‰、7.2‰、11.2‰,估计全球有约5000万癫痫患者。据2000年国内5省癫痫流行病学抽样调查表明,我国癫痫患病率为7.0‰,活动性癫痫患病率为4.6‰,以此推算,全国约有活动性癫痫患者500-600万。大多数的癫痫患者经过一段时间的规范药物治疗后,痫性发作可以得到控制。但是仍有一部分患者,药物治疗并不能够减轻发作的频率和强度,被称为难治性癫痫(Refractory epilepsy, RE)。RE又称顽固性癫痫,是指临床经过迁延,对抗癫痫药物(AEDs)治疗反应差的一组癫痫病人,即3种一线药物采用“最理想”的剂量单独或合并使用2年以上仍有癫痫发作。目前RE的发病率约10%-20%,其病程长、反复发作、致残率高,严重影响了患者的生活质量,因此了解RE的发生机制并寻找有效的治疗方法十分必要。癫痫发病机制复杂。近年受到肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)机制的启示,多药转运体在癫痫患者脑内的表达受到关注,研究最深入的是P-GP. MRP1介导的MDR。这种蛋白的跨膜结构具有能量依赖性”药泵”的功能,它能将药物和其它疏水性化合物主动转运出细胞。大多数AEDs具有较高的脂溶性,可通过被动扩散通过血脑屏障,是P-GP和MRP1的天然底物,但若脑内蛋白表达增高,毛细血管内皮细胞管腔侧的P-GP和MRP1可将AEDs泵回血中,限制脂溶性药物进入脑实质。在RE中,由于P-GP和MRP1等蛋白的过量表达,参与了对多种抗癫痫药物的转运,降低了脑组织内的血药浓度,从而导致癫痫耐药的出现。目前,PGP和MRP1的逆转剂在RE的治疗中受到重视。PGP的逆转剂包括钙通道阻滞剂、钙调蛋白抑制剂、环孢菌素类、亲脂性化合物及激素类等,MRP1的逆转剂有丙磺舒、异黄酮等。逆转剂的应用无疑是解决MDR的一种常用方法,但往往因为逆转剂的毒性较强,副作用较大而影响其在临床上的广泛引用。癫痫的病机与肝的疏泄功能异常关系密切,其风、痰、瘀产生均为肝气失于疏泄、条达的病理变化,因而癫痫的论治可以选择“从肝论治”。陈宝田教授重视癫痫“从肝论治”,运用柴胡疏肝汤治疗RE,取得了较好疗效。中医药对难治性癫痫具有确切的疗效,可能有多途径的综合靶点作用,本研究以难治性癫痫大鼠模型作为中医药治疗癫痫临床研究的突破口,以多药耐药蛋白P-GP、MRP1为切入点,探讨中药干预的可能机制。目的本研究拟建立锂-匹罗卡品难治性癫痫模型,观察柴胡疏肝汤在改善癫痫大鼠痫性发作行为及脑电图痫性波的效果,评价柴胡疏肝汤在保护神经元以及抑制多药耐药蛋白P-GP、MRP1及上游基因mRNA表达的疗效,探讨难治性癫痫中医“从肝论治”柴胡疏肝汤在治疗中的机制,为癫痫的治疗提供理论依据。方法1.难治性癫痫模型的建立采用氯化鋰-盐酸匹罗卡品的化学点燃方法制作模型。具体步骤：(1)先给予氯化鋰127mg/kg腹腔注射；(2)18-24h后腹腔注射阿托品lmg/kg; (3)30min后予10%匹罗卡品10mg/kg腹腔注射,30分钟后若无Ⅳ级以上痫性发作,则每隔30mmin继续腹腔注射匹罗卡品(10mg/kg),直至大鼠出现癫痫持续状态后停止注射。(4)癫痫持续状态60分钟,腹腔注射10%的水合氯醛(300mg/kg)终止发作。(5)癫痫持续状态后的大鼠在经过24h的急性期后,进入10-15天左右的潜伏期；(6)15天后进入慢性期,开始筛选实验动物,并以影像监控系统进行连续监测,检测时间8AM-8PM,观察时间为进入慢性期后4周(28天),若SE后大鼠在此时间内出现白发性痫性发作,则为成功的慢性难治性癫痫模型。若无痫性自发发作,则弃用。2.柴胡疏肝汤对难治性癫痫模型痫性发作及脑电图的影响将制备成功的60只难治性癫痫模型大鼠,随机分为模型组、VPA组、柴胡疏肝汤低、中、高剂量组,每组12只,另设空白对照组12只,实验共设6组。空白对照组和模型组常规饲养,给予生理盐水2m1/次灌胃,VPA组(德巴金)用量为200mg/kg/d,柴胡低、中、高剂量组依次为4.5g/kg/d,9g/kg/d,18g/kg/d,每日9am、6pm各给药1次。各组大鼠均于慢性期后,统一灌胃治药,连续给药8周(56天)。视频记录大鼠慢性期4周、药物治疗4周、8周后痫性发作行为记录,包括大鼠痫性发作次数,平均持续时间,发作级别及各组大鼠体重的变化。于8周治疗结束后,以上每组随机各取2只大鼠进行脑电图描记。3.柴胡疏肝汤对痫性大鼠海马和颞叶神经元损伤的影响各组给药后难治性癫痫模型大鼠30只,模型组、VPA组、柴胡疏肝汤低、中、高剂量组,每组各6只,另有空白对照组6只,共6组。腹主动脉灌注4%多聚甲醛的方法固定大鼠大脑,常规制备石蜡切片(含皮层和海马)。HE染色观察海马各区及颞叶皮层神经元形态结构的改变,尼氏染色观察海马各区及颞叶皮层脑神经元存活情况、尼氏小体丢失情况。4.柴胡疏肝汤对痫性大鼠脑内多药耐药蛋白P-GP和MRP1及其上游基因的影响各组给药后难治性癫痫模型大鼠30只,模型组、VPA组、柴胡疏肝汤低、中、高剂量组,每组各6只,另有空白对照组6只,共6组。通过免疫组化法、免疫印迹法、荧光定量PCR法检测各组大鼠脑内海马和颞叶多药耐药蛋白P-GP和MRP1及其上游基因mRNA的表达。5.统计学方法数据用SPSS13.0软件进行统计学分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示。各组大鼠于不同用药时间点发作次数、发作时间、体重变化比较,采用单个重复测量的方差分析进行统计分析,不同用药组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计分析。各组大鼠痫性发作级别采用多组等级资料,对等级资料采用频数进行统计描述,采用多个独立样本非参数检验Kruskal-Wallis法,尼氏小体数、免疫组化、免疫印迹法、荧光定量PCR采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计分析,P<0.05为有统计学意义。结果1.难治性癫痫模型的制备在实验中,共对88只SD大鼠腹腔注射氯化鋰-盐酸匹罗卡品,制备难治性癫痫模型。其中6只大鼠反复给予匹罗卡品,始终无法诱发出癫痫持续状态,弃用,其余82只大鼠在首次或追加匹罗卡品后开始出现痫性发作,并逐步达到SE。在急性期内(24h)内,有9只大鼠因癫痫频繁抽搐而死亡。在潜伏期内(2周),因频繁抽搐以及不能自主进食衰竭死亡共13只,多在SE后一周死亡,进入慢性期。在慢性期4周,60只存活的的大鼠均出现自发发作,发作级别从Ⅰ级逐渐发展至V级,慢性期内无致痫大鼠死亡2.柴胡疏肝汤对难治性癫痫模型痫性发作的影响2.1各致痫组大鼠治疗前后痫性发作次数的变化采用单个重复因素测量的方差分析,3个时间点差异有统计学意义(F=207.535,P=0.000),各组之间有统计学意义(F=2.755,P=0.037),各时间点与分组间有交互效应(F=48.098,P=0.000)；用药前,各致痫组大鼠痫性发作次数无统计学意义(P>0.05)；用药4周、用药8周大鼠痫性发作次数均有差异(P<0.05或P<0.01)。组间多重比较,用药4周后,与模型组相比,VPA、柴胡高剂量组均能减少大鼠痫性发作次数,有统计学意义(P<0.01或P<0.05)柴胡低、中剂量与模型组无统计学意义(P>0.05),但均与柴胡高剂量组有统计学意义(P<0.05)；用药8周后,与模型组相比,各组均能减少大鼠痫性发作的次数,均有统计学意义(P<0.01), VPA、柴胡低、中剂量组与柴胡高剂量组均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。各组与治疗前相比,模型组无统计学意义(P>0.05), VPA、柴胡低、中、高剂量组差异均有统计学意义(P<0.01)。2.2各致痫组大鼠治疗前后痫性平均发作时间的变化采用单个重复因素测量的方差分析,3个时间点差异有统计学意义(F=182.683,P=0.000),各组之间差异有统计学意义(F=4.706,P=0.002),各时间点与分组间有交互效应(F=26.995,P=0.000)；用药前,各致痫组大鼠痫性发作时间无统计学意义(P>0.05)；用药4周、用药8周大鼠痫性发作时间均有差异(P<0.01)。组间多重比较,用药4周后,与模型组相比,VPA、柴胡高剂量组均能减少痫性发作平均时间,有统计学意义(P<0.01),柴胡低、中剂量与柴胡高剂量组均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；用药8周后,与模型组相比,VPA、柴胡低、中、高剂量组均能减少大鼠痫性发作平均时间,有统计学意义(P<0.05或P<0.01), VPA、柴胡低、中剂量组与柴胡高剂量组均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。各组与治疗前相比,模型组、柴胡低剂量组无统计学意义(P >0.05), VPA、柴胡中、高剂量组差异均有统计学意义(P<0.01)。2.3各致痫组大鼠治疗后痫性发作级别的比较采用非参数检验Kruskal-Wallis法,用药前,各致痫组大鼠均表现Ⅳ级或V级痫性发作,模型组、VPA、柴胡低、中、高剂量组发作级别秩次分别为31.00、28.50、33.50、31.00、28.50,5组之间差异无统计学意义(χ2=0.919,P=0.922)；治疗4周后,5组之间差异有统计学意义(χ2=12.945,P=0.012)；发作级别秩次分别为42.25、22.75、35.08、29.75、22.67,根据平均秩次推断,柴胡高剂量组发作级别最低,VPA组次之,模型组最高。治疗8周后,5组之间差异有统计学意义(χ2=15.776,P=0.003)；发作级别秩次分别为44.63、26.38、34.13、28.13、19.25,根据平均秩次推断,以柴胡高剂量组发作级别最低,VPA组次之,模型组最高。3.各组大鼠治疗前后体重的变化采用单个重复因素测量的方差分析,3个时间点大鼠体重差异有统计学意义(F=672.873,P=0.000),各组之间差异有统计学意义(F=203.671,P=0.000),各时间点与分组间有交互效应(F=51.172,P=0.000)；用药前、用药4周、用药8周大鼠体重均有差异(P<0.01)。组间多重比较,给药前,各致痫组大鼠与空白对照组大鼠之间均有统计学意义(P<0.01),各致痫组模型之间无统计学意义(P>0.05)。治疗4周后,各致痫组大鼠与空白对照组相比,均有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比,VPA、柴胡中、高剂量组大鼠体重增加,有统计学意义(P<0.01)；柴胡低、中剂量组与柴胡高剂量组均有统计学意义(P<0.01)。治疗8周后,各致痫组大鼠与空白对照组相比,均有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比,VPA、柴胡低、中、高剂量组大鼠体重均增加,有统计学意义(P<0.01),柴胡低、中剂量组与柴胡高剂量组均有统计学意义(P<0.01)。与治疗前相比,除模型组无统计学意义(P>0.05)外,空白对照组、VPA、柴胡低、中、高剂量组均有统计学意义(P<0.01)。4.柴胡疏肝汤对难治性癫痫模型脑电图的影响空白对照组大鼠脑电图以基础波即α,β波为主,无明显节律性；模型组大鼠出现大量高幅痫波,多为棘波、尖波、棘慢复合波,出现大量痫性放电；柴胡疏肝汤低、中剂量组大鼠均可见较多尖波、棘波、棘慢复合波,但波幅较模型组低。VPA组和柴胡疏肝汤高剂量组大鼠痫性放电明显受到抑制,只见极少量棘波或尖波,而以柴胡疏肝汤高剂量组出现的最少。5.柴胡疏肝汤对难治性癫痫模型大鼠海马和颞叶神经元的影响5.1 HE染色结果,空白对照组大鼠海马CA1区及齿状回锥体细胞、颗粒细胞数量众多,胞浆透明,各区神经元细胞核呈圆形或椭圆形,胞核蓝染,核仁清晰,形态正常。模型组大鼠海马锥体细胞、颗粒细胞排列较松散,各区可见细胞核固缩、碎裂,或胞核水肿、空泡。VPA组、中药柴胡疏肝汤各剂量组的大鼠海马神经元细胞排列尚密集,可见部分细胞核固缩,或胞核水肿,神经元损伤程度轻于模型组。5.2尼氏(Nissl)染色结果,空白对照组大鼠海马CA1、齿状回见大量致密锥体细胞、颗粒细胞,各区神经元细胞核呈圆形或椭圆形,胞核淡染,核仁清晰,胞浆透明,尼氏小体丰富。模型组大鼠海马锥体细胞、颗粒细胞排列松散,部分细胞核轮廓模糊,胞浆尼氏小体减少；VPA组、中药柴胡疏肝汤各剂量组大鼠海马仍有丰富的锥体细胞、颗粒细胞,各区细胞核轮廓尚清,胞浆尼氏小体有所减少,神经元损伤程度较模型组轻。5.3海马CA1、DG区和颞叶皮层尼氏小体数的比较尼氏染色显示,各组大鼠海马CA1、DG区和颞叶皮层,尼氏小体数差异有统计学意义(P<0.01)。组间多重比较,空白对照组、VPA组、柴胡高剂量组尼氏小体数高于模型组(P<0.01或P<0.05),柴胡低、中剂量组与模型组无统计学意义(P>0.05)。柴胡高剂量组中尼氏小体数高于柴胡低、中剂量组(P<0.01或P<0.05)。但在DG区,柴胡高剂量组与中剂量组无统计学意义(P>0.05)。6.柴胡疏肝汤对多药耐药蛋白P-GP及其上游基因MDR1mRNA的影响免疫组化检测IOD值：各组大鼠海马区CA1、DG和颞叶皮层区,P-GP蛋白表达IOD值有统计学意义(P<0.01)。组间多重比较,CA1和DG区,空白对照组、柴胡高剂量组低于B组(P<0.01), VPA组高于模型组(P<0.05或P<0.01)。柴胡高剂量组低于柴胡低、中剂量组(P<0.05或P<0.01),但高于空白对照组(P<0.05)。在颞叶皮层,空白对照组、柴胡高剂量组低于模型组(P <0.01),VPA、柴胡低、中剂量组与模型组相比无统计学意义(P>0.05)。柴胡高剂量组低于VPA、柴胡低、中剂量组(P<0.01或P<0.05),与空白对照组相比无统计学意义(P>0.05)。免疫组化检测阳性细胞数：各组大鼠海马CA1、DG区和颞叶皮层区,免疫组化检测P-GP蛋白表达的阳性细胞数差异有统计学意义(P<0.01)。组间多重比较,VPA组高于模型组(P<0.05或P<0.01),空白对照组、柴胡高剂量组低于模型组(P<0.05或P<0.01)。柴胡高剂量组低于柴胡低剂量组(P<0.05),与空白对照组、柴胡中剂量组无统计学意义(P>0.05)。Western Blotting检测蛋白：各组大鼠海马、颞叶皮质区蛋白表达有统计学意义(P<0.01)。组间多重比较,海马区,VPA组高于模型组(P<0.05),空白对照组、柴胡各剂量组均低于模型组(P<0.05或P<0.01)。柴胡高剂量组低于柴胡低、中剂量组(P<0.05或P<0.01),但高于空白对照组(P<0.01)；颞叶皮质区,VPA组与模型组无统计学意义(P>0.05),空白对照组、柴胡中、高剂量组低于模型组(P<0.01)。柴胡高剂量组低于柴胡低、中剂量组(P<0.05或P<0.01),与空白对照组无统计学意义(P>0.05)。荧光定量PCR法检测上游基因MDR1 mRNA的表达：各组大鼠海马、颞叶皮质区,MDR1-mRNA表达有统计学意义(P<0.01)。组间多重比较显示,VPA组表达高于模型组(P<0.01),空白对照组、柴胡高剂量组表达低于模型组(P<0.05或P<0.01),柴胡低、中剂量组表达与模型组无统计学意义(P>0.05)。柴胡高剂量组表达高于空白对照组组(P<0.05),在海马区,柴胡高剂量组表达低于柴胡低、中剂量组(P<0.05或P<0.01)。7.柴胡疏肝汤对多药耐药相关蛋白MRP1及其上游基因mRNA的影响免疫组化检测IOD值：各组大鼠海马CA1、DG区和颞叶皮层区,MRP1蛋白表达有统计学意义(P<0.01)。多重比较,在CA1区,VPA组高于模型组(P<0.05),空白对照组、柴胡高剂量组低于模型组(P<0.01)。柴胡高剂量组低于柴胡低剂量组(P<0.05),与空白对照组、柴胡中剂量组相比无统计学意义(P>0.05)。在DG区,VPA组高于模型组(P<0.01),空白对照组、柴胡高剂量组低于模型组(P<0.01)。柴胡高剂量组低于柴胡低、中剂量组(P<0.01),但高于空白对照组(P<0.01)。在颞叶皮层区,VPA、柴胡低、中剂量组与模型组相比无统计学意义(P>0.05),空白对照组、柴胡高剂量组低于模型组(P<0.01)。柴胡高剂量组低于柴胡低、中剂量组(P<0.05),但高于空白对照组(P<0.05)。免疫组化检测阳性细胞数：各组大鼠海马CA1、DG区和颞叶皮层区,MRP1蛋白表达有统计学意义(P<0.01)。多重比较,空白对照组、柴胡高剂量组低于模型组(P<0.05或P<0.01), VPA组高于模型组(P<0.05),柴胡高剂量组低于柴胡低剂量组(P<0.05或P<0.01),与空白对照组、柴胡中剂量组无统计学意义(P>0.05)。在DG区,VPA组与模型组无统计学意义(P>0.05)。Western Blotting检测蛋白表达：各组大鼠海马、颞叶皮质区蛋白表达有统计学意义(P<0.01)。多重比较,VPA、柴胡低剂量组与模型组无统计学意义(P>0.05),空白对照组、柴胡中、高剂量组低于模型组(P<0.05或P<0.01)。柴胡高剂量组低于柴胡低、中剂量组(P<0.05或P<0.01)。在海马区,柴胡高剂量组高于空白对照组(P<0.01)。荧光定量PCR法检测上游基因MRP1 mRNA的表达：各组大鼠海马、颞叶皮质区,MRP1-mRNA表达有统计学意义(P<0.01)。多重比较,海马区,VPA组表达高于模型组(P<0.05),空白对照组、柴胡高剂量组表达低于模型组(P<0.05或P<0.01),柴胡低、中剂量组表达与模型组无统计学意义。柴胡高剂量组表达低于柴胡低剂量组(P<0.05),与空白对照组、柴胡中剂量组无统计学意义(P>0.05)。颞叶皮质区,VPA组表达高于模型组(P<0.01),空白对照组、柴胡中、高剂量组表达低于模型组(P<0.05或P<0.01),柴胡低剂量组表达与模型组无统计学意义(P>0.05)。柴胡高剂量组表达与柴胡低、中剂量组无统计学意义(P>0.05),但高于空白对照组(P<0.05)。结论：1.本研究成功建立了锂-匹罗卡品癫痫持续状态后慢性难治性癫痫模型,操作相对简单、成功率较高、稳定性较好,为后续实验打下了较好的基础。2.柴胡疏肝汤有较好的抗癫痫作用,可以减少难治性癫痫模型大鼠的痫性发作次,减少平均发作时间,减轻发作级别,并可改善痫性大鼠的整体状态,增加大鼠的体重,且存在一定的量效、时效依赖性。3.通过HE染色和尼氏染色证实,柴胡疏肝汤可以减轻痫性大鼠脑内海马CA1、齿状回以及颞叶神经元的损伤,减少尼氏小体的损失。4.中药复方柴胡疏肝汤具有一定的抑制P-GP、MRP1的药物转运体功能,可以下调P-GP、MRP1的表达。通过免疫组化、免疫印迹法、荧光定量PCR法结果证实,柴胡疏肝汤可以抑制大鼠海马CA1、齿状回以及颞叶P-GP、MRP1蛋白的表达,抑制上游基因MDR1mRNA、MRP1mRNA的表达,且存在一定的量效依赖性。而VPA可以增强相应部位P-GP、MRP1极其上游基因mRNA的表达。