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前列腺癌是西方国家发病率最高的恶性肿瘤之一,目前晚期前列腺癌的治疗方案有限,而且仅能起到延缓疾病的进展,而无法起到治愈的效果。我国前列腺癌发病率呈明显上升趋势。我国大多数前列腺癌患者在初诊时已出现转移,当疾病进展为转移性去势抵抗性前列腺癌,患者的预后较差。在前列腺癌的发生发展过程中,EGFR的过表达起着相当重要的作用,EGFR信号传导通路是前列腺癌发生发展的关键分子机制。EGFR过表达阳性提示前列腺癌患者的预后较差。研究中发现,EGFR在前列腺癌中的阳性表达率明显高于前列腺增生组织,而且EGFR阳性表达率与Gleason分级、临床分期、淋巴结转移呈正相关,临床数据表明,EGFR信号通路可以激活雄激素受体,增强受体介导的肿瘤生长。这些研究结果提示:在前列腺癌的发生、发展、转移等过程中,EGFR起着重要的作用。以EGFR为靶点的药物研发也越来越受到重视,研制与开发新型的EGFR抑制剂是新药研发的热点。如今,应用计算机辅助筛选技术研究FDA已批准应用于临床的药物,这一新型的药物筛选机制不仅可以富集活性化合物,同时可以大量的降低成本并节约时间,发现这些药物新的适应症。本课题选取EGFR作为靶蛋白,idock软件模拟蛋白-配体对接分子作用,从FDA已经批准的药物中筛选出能与EGFR蛋白分子成功对接的药物,通过MTT实验初步检测这些药物对前列腺癌细胞的抑制作用。体外细胞实验(流式细胞技术以及Western blotting)和体内动物实验(裸鼠移植瘤)进一步验证新型的EGFR抑制剂对前列腺癌的抑制作用,探讨其抗癌机制。本课题通过计算机筛选和生物学实验证实新型的EGFR抑制剂能够有效抑制EGFR信号通路,阻滞前列腺癌细胞的生长增殖,促进凋亡作用。这种新型的EGFR抑制剂可能成为治疗前列腺癌的小分子靶向药物,实现其老药新用的价值,为前列腺癌靶向药物的研发及治疗方案的优化奠定理论基础。我们通过对EGFR抑制剂研究,为我国抗肿瘤药物的筛选和新药发现提供新的方向。它可能作为一种治疗晚期前列腺癌的新的有效的治疗策略。[目 的]通过计算机筛选和生物学实验的方法验证新型的EGFR抑制剂能够抑制前列腺癌细胞的生长增殖,对EGFR信号通路有阻断作用,并探讨其抗癌的作用机制。[方法](1)以EGFR作为靶蛋白,应用计算机idock软件模拟蛋白-配体对接分子作用,发现EGFR的候选抑制剂。(2)MTT检测筛选出的EGFR抑制剂对前列腺细胞活性的抑制作用,发现新型的EGFR抑制剂。用不同浓度的EGFR抑制剂分别处理PC-3、DU 145细胞株,MTT检测其对前列腺癌细胞活性的影响。(3)应用免疫印迹(Western blotting)方法检测EGFR抑制剂处理后的前列腺癌细胞蛋白水平的表达。包括EGFR蛋白的表达变化以及对其下游蛋白ERK和AKT等的作用。(4)应用流式细胞技术检测EGFR抑制剂对前列腺癌细胞凋亡和坏死的影响。Western blotting检测其对凋亡相关蛋白(PARP和Caspase-3)的作用。(5)在裸鼠体内进行荷瘤实验,检测EGFR抑制剂是否可以抑制前列腺癌移植瘤在动物体内的生长。裸鼠腹腔注射EGFR抑制剂对移植瘤的抑制作用及其毒副作用。[结果](1)药物数据库由3167种已被FDA批准临床使用的药物组成.。利用开放的网络平台软件idock对3167个化合物配对ATP结合位点的EGFR进行运算,对接的可视结果在 http://istar.cse.cuhk.edu.hk/idock/iview/?4JPS-dbap+fda+npc 获得。筛选到的6个化合物分别为:双溴丙脒二盐酸盐(Dibromopropamidine Dihydrochloride)、仑哌隆(Lenperone)、阿伐那非(Avanafil)、氟哌利多(Droperidol)、盐酸阿夫唑嗪(Alfuzosin hydrochloride)、多潘立酮(Domperidone)。idock 的评分为-9.68～-6.95kcal/mol,RF-评分为 6.74～7.90pKd之间。(2)对计算机筛选的6个化合物进行MTT检测,结果显示2个化合物对前列腺癌细胞株(PC-3和DU145)均有抑制作用。其中双溴丙脒二盐酸盐的抑制作用最强(PC-3 IC50=3.28μM,DU145 IC50=2.81μM),双溴丙脒二盐酸盐对PC-3和DU145细胞株的抑制作用随药物浓度的增加而逐渐增强,呈现良好的浓度依赖关系。双溴丙脒二盐酸盐在不同时间点(24h,48h,72h)作用PC-3细胞株,72小时抑制作用最强,呈现出时间依赖性抑制作用的特征。与已知的EGFR 抑制剂吉非替尼(Gefitinib)(IC50=5.92 μM)和拉帕替尼(Lapatinib)(IC50=6.79μM)相比,双溴丙脒二盐酸盐的抑制作用更强。(3)idock软件预测双溴丙脒二盐酸盐与EFGR对接的构象图。双溴丙脒二盐酸盐通过与EGFR的GLY796、ASP855位点形成氢键,从而与EGFR底物竞争结合。(4)Western blotting方法检测双溴丙脒二盐酸盐对前列腺癌细胞株(PC-3和DU145)EGFR靶蛋白有抑制作用,明显抑制了 EGFR的磷酸化,并抑制通路下游蛋白AKT、ERK和Bcl-2的表达。(5)双溴丙脒二盐酸盐通过诱导前列腺癌细胞的凋亡发挥抗癌作用。流式细胞术检测不同浓度的双溴丙脒二盐酸盐对前列腺癌细胞(PC-3和DU145),随着药物浓度的增加前列腺癌细胞早期凋亡比例和晚期凋亡/坏死比例逐渐增加,呈现良好的浓度依赖关系。Western blotting检测双溴丙脒二盐酸盐可以引起细胞内Caspase-3和PARP的裂解激活。(6)体内实验建立PC-3前列腺癌细胞移植瘤的裸鼠模型,腹腔注射双溴丙脒二盐酸盐、吉非替尼(40mg/kg/d)21天。与对照组相比,腹腔注射双溴丙脒二盐酸盐(实验组)可以显著抑制肿瘤的生长。双溴丙脒二盐酸盐组抑制效果优于吉非替尼组。三组的裸鼠均未出现死亡,体重亦无明显差异。[结论]本课题应用计算机idock软件和生物学实验验证:抗菌药双溴丙脒二盐酸盐作为一种新型EGFR抑制剂,抑制前列腺癌细胞的生长增殖,阻断EGFR信号通路并诱导前列腺癌细胞的凋亡。它可以作为治疗前列腺癌有效的小分子靶向药物,发挥其老药新用的价值。