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流感病毒是造成历史上多次流感大流行的病原体,也是引起季节性流行性感冒发生的病原体。流感病毒属于正黏病毒科,分为甲、乙、丙三型,其中甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是造成人和多种动物感染的主要病原体。在全世界范围内,每年都会有大量易感人群因感染流感病毒发病甚至死亡。由于流感病毒变异速度很快,流感疫苗需要逐年更新,因此具有广谱保护效果的通用流感疫苗成为目前流感疫苗研究的方向和热点。H1N1亚型流感病毒是人群中造成季节性流行性感冒的主要病原体之一。H1N1亚型人流感病毒的分离株众多、不同分离株序列差异较大,普通的季节性流感疫苗不能对所有毒株都产生保护作用。我们实验室前期通过“共有序列+保守表位”的方式设计出一条针对H1N1亚型流感病毒的HA蛋白通用序列——CH1-1。在本实验中,我们用DNA疫苗的方式在小鼠体内检测了CH1-1所诱导的体液免疫应答以及细胞免疫应答,并对其广谱反应性做以评价。结果表明接种了p CH1-1的小鼠血清对NC99和FM47病毒有中和活性。免疫小鼠的T细胞可产生对SC09、NC99和FM47几个代表株病毒抗原的细胞免疫反应。为了同时获得对SC09有中和活性的抗体,我们在DNA免疫组合中加入了表达SC09的HA的基因,p CH-1和p SC09-HA两种质粒混合免疫小鼠。得到的免疫血清对包括SC09在内的三株病毒都产生很强的交叉中和活性;SC09、NC99、FM47三种抗原体外刺激T细胞也发现,细胞上清中IFNγ含量都有很大提高。混合质粒免疫过的小鼠能抵抗致死剂量SC09、NC99和FM47等病毒的攻击,病毒攻毒免疫小鼠的肺脏病变明显减弱,攻毒14天后小鼠肺内未检测到病毒残留,这说明两种抗原的组合能诱导对许多种H1N1病毒的广谱免疫应答。用CH1-1基因替换PR8病毒的HA基因构建的重组病毒株PR8-CH1-1是一株天然的弱毒株。PR8-CH1-1滴鼻免疫小鼠后用SC09和NC99两株病毒检测保护效果。结果发现,所有免疫过的小鼠在用致死剂量的两株病毒攻毒后均得到很好的保护,死亡率为0,肺脏只有轻微病变,攻毒14天后小鼠肺内未检测到病毒残留。这说明以PR8-CH1-1作为减毒活疫苗能诱导对许多种H1N1病毒的广谱保护性免疫应答。甲型流感病毒一直威胁人类健康,接种疫苗是预防甲型流感病毒感染的有效途径。哺乳动物二倍体细胞培养系统是生产甲型流感疫苗的新一代培养介质。在前期工作中通过病毒基因组改造,我们已经获得Vero细胞高产的流感病毒疫苗骨架株,本研究将基于该Vero细胞高产骨架株构建H7N9甲型流感病毒疫苗株,研究和检验该高产疫苗骨架株是否支持新近流行的H7N9亚型流感病毒疫苗株在Vero细胞中的生长,为应对人感染H7N9病毒提供细胞介质疫苗候选株。首先通过甲型流感病毒反向遗传学技术,将H7N9亚型流行株的HA和NA基因(2条编码病毒表面蛋白的基因)与Vero细胞高产疫苗骨架株PR8-4mut的PB1、PB2、PA、NP、M、NS基因(6条编码病毒内部蛋白的基因),通过6+2重组法拯救出4mut-H7N9病毒。同时拯救对照病毒PR8-H7N9(HA、NA来自于H7N9,6条编码病毒内部蛋白的基因来自于野生型PR8病毒)。通过生长曲线和空斑形态等病毒学方法比较PR8-H7N9和4mut-H7N9两株病毒在Vero细胞上的生长性状;通过免疫印迹和考马斯亮蓝染色检测4mut-H7N9病毒产量最高时间点时,PR8-H7N9和4mut-H7N9两株病毒的特定蛋白或大部分蛋白的产量差异。对比两株病毒的生长曲线发现,感染后72小时4mut-H7N9的病毒滴度比PR8-H7N9滴度高约3000倍;空斑实验显示,培养48小时后,4mut-H7N9在Vero细胞上形成直径约1毫米的空斑,而PR8-H7N9只能形成针孔大小的空斑;考马斯亮蓝染色比较两株病毒总蛋白含量表明,两株病毒以相同MOI感染Vero细胞后72小时收集的上清中,4mut-H7N9各病毒蛋白组分含量均远高于PR8-H7N9;用免疫印迹法检测两株病毒上清中PA、NP和M1蛋白的相对含量得到了与考马斯亮蓝染色相似的结果;4mut-H7N9病毒没有改变胰酶依赖性保证了该高产疫苗株的安全性。因此,通过反向遗传学技术将PR8-4mut的6条内部基因加上H7N9的HA和NA基因构建的4mut-H7N9能够极大地提高病毒在Vero细胞中的增殖速度,可作为以Vero细胞为生产介质的H7N9高产疫苗备选株。