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微囊藻毒素(Microcystin,简称MC)是一种在富营养化水华污染中出现频率高、产生量大、造成危害严重的藻类毒素。微囊藻毒素通过污染水资源不仅可以造成鱼类、鸟类、野生动物及家畜的死亡,而且会对人类健康产生较大的危害,是一种潜在的环境致(促)癌物。目前有关微囊藻毒素的生物毒性研究主要集中在它的肝脏毒性上,而大量的流行病学调查显示我国南方一些地区原发性肝癌、大肠癌等恶性肿瘤高发均与饮用水中微囊藻毒素的污染存在正相关关系。因此深入探讨微囊藻毒素的致(促)癌作用具有重要的意义。
本论文采用激活肿瘤病毒和细胞转化实验等多种生物学技术,针对微囊藻毒素最常见的一种异构体——MC-LR的促癌性进行深入的探讨,并将EB肿瘤病毒抗原激活系统应用于云南昆明滇池水样的分析,从生物毒理学的角度评价滇池水体中藻类毒素的潜在促癌作用。
论文首先通过EB肿瘤病毒抗原的激活系统,以两类携带EB病毒基因的细胞(Raji细胞和B95-8细胞)作为靶细胞详细研究MC-LR的促癌作用。通过细胞毒性实验筛选出合适的MC-LR浓度进行EB病毒抗原激活实验。激活实验每次均设空白对照组、阳性对照组和实验组。阳性对照组包括:丁酸、巴豆油、TPA单独作用组以及丁酸与巴豆油协同作用组;实验组包括:MC-LR单独作用组及其分别与丁酸、巴豆油、TPA协同作用组。采用免疫酶法将待测细胞中的抗原包被在孔板内,依次加入一抗、酶标二抗和底物,根据酶作用于底物后的显色颜色来检测细胞中的EB病毒抗原,明确MC-LR对EB病毒抗原的激活作用,从而说明MC-LR的促癌作用。
然后采用体外培养细胞的恶性转化系统对MC-LR的促癌作用进行更加深入的研究。采用包括细胞生长特性的改变、在软琼脂中形成克隆的能力以及在免疫缺陷动物体内的致瘤能力等多项敏感、特异的生物学指标,检测MC-LR对3T3永生细胞恶性转化的诱导作用,进一步明确MC-LR的促癌性。实验首先将3T3细胞在含有MC-LR的培养液中培养一段时间后,通过显微镜观察细胞形态学及其生长接触抑制特性的改变,并通过细胞生长实验和血清依赖性实验检测细胞生长特性(包括细胞生长速度和对血清的依赖性)的变化,初步确定3T3细胞在MC-LR的诱导作用下发生了恶性转化。然后将转化后的3T3细胞分别进行软琼脂克隆培养和小鼠体内致瘤实验,检验其是否能在软琼脂中锚着独立性生长形成克隆,并在免疫缺陷小鼠体内浸润性生长形成肿瘤,进一步明确MC-LR对3T3细胞恶性转化的诱导作用,从而检测其促癌性。在对纯毒素MC-LR进行研究的基础上,采用EB肿瘤病毒激活系统对云南昆明滇池的水样进行检测,从生物毒理学的角度评价滇池水体中包括微囊藻毒素在内的多种藻类毒素的潜在促癌性。分别于蓝藻爆发的高峰季节(夏季)和非高峰季节(冬季)两次采集滇池的水样。通过过滤、蒸发、浓缩、提取等实验方法,得到滇池水样的水浓缩液和乙醚提取液。应用免疫酶法分别检测滇池水样的水浓缩液和乙醚提取液对Raji细胞中EB病毒抗原表达的激活作用,从而说明滇池水体的潜在促癌性,并采用高效液相色谱.质谱(HPLC-MS)联用的方法,对滇池水样中的微囊藻毒素进行定性和定量分析。