秸秆还田是当今世界上普遍重视的一项耕作管理措施,不仅可以减少化肥使用,提高土壤有机质含量,从而保持土壤肥力,还能杜绝秸秆焚烧,减轻环境污染。土壤微生物不仅是土壤有机质和养分循环的动力,土壤微生物多样性对于反映土壤肥力状况及生态环境演变还具有重要的指示作用。细菌漆酶在木质素降解和土壤有机质的周转过程中发挥了重要的作用,是土壤质量和功能的潜在指标。与真菌漆酶相比,细菌漆酶在热稳定性、氯离子的耐受性及最适pH范围广等方面更有优势,而且无需糖基化的修饰,容易进行异源表达,使细菌漆酶更适用于纺织、造纸、环保等行业。为理解秸秆还田土壤有机质的周转过程以及相应的微生物驱动机制,对细菌漆酶资源进行开发和利用,本论文对秸秆还田土壤微生物及其细菌漆酶的多样性进行了深入研究。首先采用16S rRNA基因和ITS扩增子测序,分析了秸秆还田土壤耕层和下层的微生物群落结构。秸秆还田土壤细菌和真菌群落有丰富的多样性,具有独特的组成和结构。通过不同土层比较发现,虽然细菌丰度在耕层土壤和下层土壤没有显著差异,但细菌群落结构明显不同,真菌多样性在不同土层变化不大。以秸秆还田耕层土壤为材料筛选到7株产漆酶细菌,除两株为芽孢漆酶外均为胞内漆酶。通过宏基因组测序技术对秸秆还田土壤耕层微生物进行了全面解析,发现其中的功能基因以氨基酸代谢、碳水化合物代谢和能量代谢相关基因为主,与牛瘤胃、天牛肠道、堆肥等木质纤维素降解菌群的代谢模式相似,表明在秸秆还田土壤中存在大量在秸秆降解过程中发挥重要作用的微生物。而其中碳水化合物活性酶编码基因的组成和分布又与其他木质纤维素降解菌群有所区别,暗示秸秆还田土壤微生物可能与其他木质纤维素降解菌群有不同的木质纤维素降解方式。利用隐含马尔科夫模型对秸秆还田土壤宏基因组中预测基因编码的氨基酸序列进行检索,共获得322个可能的细菌漆酶。这些细菌漆酶具有一定的新颖性和丰富的多样性,主要来源于变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes),表明在秸秆还田土壤中以变形菌门为主,在放线菌门和芽单胞菌门的协同作用下进行木质素的加工和代谢。通过秸秆还田土壤来源的细菌漆酶和参考序列共同构建系统发育树进一步表明秸秆还田土壤中细菌漆酶的多样性,发现其中很多可能具有优良的酶学性质。选取部分细菌漆酶基因进行PCR扩增及测序,结果表明宏基因组数据预测的基因中绝大部分代表了秸秆还田土壤微生物中真实存在的基因。对于其中5个不具有完整开放读码框的细菌漆酶基因,利用热不对称交错PCR扩增其侧翼序列,经过序列拼接及开放读码框预测后获得其全长序列。将克隆到的7个细菌漆酶基因的完整开放读码框翻译成氨基酸序列,通过序列比对发现它们之间有较大的差异并且具有较高的新颖性。尽管这7个细菌漆酶的氨基酸序列在整体水平上有很大的差异,但其铜离子结合位点高度保守,预测的三维结构也比较相似,均为典型的三域漆酶。其中四个含有双精氨酸转运系统的信号肽,表明其可以通过双精氨酸转运系统穿过细胞膜。将细菌漆酶基因lacS1在大肠杆菌中进行异源表达,通过微好氧发酵,成功表达出有活性的重组漆酶LacS1。重组漆酶LacS1发挥催化活性的pH范围较宽,最适pH为5.0,在pH 5.0-9.0的条件下具有较好的稳定性。此外,该重组酶的最适温度为50℃,50℃处理1 h后仍剩余25%左右的活力;有较高的Cl~-耐受性。这些性质表明其潜在的应用前景。本论文通过对秸秆还田土壤微生物及其细菌漆酶多样性进行深入研究,全面解析了秸秆还田土壤微生物的群落结构特征,发现其中存在大量特异的在秸秆降解过程中发挥重要作用的微生物,其细菌漆酶具有一定的新颖性和丰富的多样性,很多可能具有优良的酶学性质,为秸秆还田土壤木质素的降解及有机质周转过程的理解提供了指导,同时为细菌漆酶资源的开发和利用提供了材料。