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角质酶是一种可以降解角质并产生大量脂肪酸单体的水解酶。角质酶是一种多功能酶,可水解可溶性酯、不溶性甘油三酯和各种聚酯,同时还能催化酸与醇的酯化、脂肪酸盐与醇的转酯化反应,因此在食品工业、化工工业等诸多领域都具有广泛的应用。近年来研究发现,角质酶可实现棉纤维的生物精练和合成纤维的生物改性,是推动纺织工业清洁生产的关键酶制剂。国外对真菌角质酶进行了深入的研究,但由于存在基因工程异源表达时表达量低和稳定性差等问题,至今没有实现工业化生产。与真菌角质酶相比,细菌角质酶具有催化效率高、基因工程异源表达技术成熟等方面的优势,但是国内外关于细菌角质酶的报道很少,迄今为止没有细菌角质酶基因鉴定的报道,因此细菌角质酶的研究受到限制。本论文完成了嗜热放线菌Thermobifida fusca角质酶的基因鉴定,实现了其在大肠杆菌中的高效表达及分子改造,主要结果如下:1.依次经过硫酸铵沉淀,Phenyl HP Sepharose FF疏水色谱,DEAE Sepharose FF阴离子交换色谱,从角质诱导的T. fusca发酵液中纯化得到电泳纯pNPB水解酶,比酶活由52.3 U/mg提高至398.6 U/mg,纯化倍数为7.6,回收率为9.3%。此外,通过硫酸铵沉淀,Phenyl HP Sepharose FF疏水色谱,CM Sepharose FF阳离子交换色谱,从重组Bacillus subtilis发酵液中纯化得到电泳纯Fusarium solani pisi角质酶。以F. solani pisi角质酶为对照品,苹果角质为底物,采用GC/MS分析,鉴定纯化得到的pNPB水解酶与F. solani pisi角质酶类似,能水解苹果角质并产生特征性产物,具有角质酶功能。2.纯化得到的T. fusca pNPB水解酶经肽指纹图谱鉴定,与数据库中Tfu0882和Tfu0883两个甘油三酯酶相符。通过N端测序得到纯化的蛋白N端前九个氨基酸为:ANPYERGPN。以T. fusca总DNA为模板,设计引物PCR得到编码Tfu0882和Tfu0883成熟蛋白的基因,并和具有PelB信号肽和6-His纯化标记的pET20b（+）质粒相连,使Tfu0882和Tfu0883在E. coli BL21（DE3）中过量表达。通过IPTG诱导,重组菌发酵上清液pNPB水解酶酶活Tfu0882为52.5 U/mL,Tfu0883为90.6 U/mL,分别是T. fusca诱导发酵液的4.37和7.56倍。采用Ni亲和柱对重组Tfu0882和Tfu0883进行分离纯化,纯化后重组蛋白达到电泳纯,重组Tfu0882和Tfu0883的pNPB水解酶比活力分别为223.1 U/mg、458.2 U/mg,并且两者均能水解角质并产生特异性产物,由此可确定,Tfu0882和Tfu0883是编码T. fusca角质酶基因。3.考察IPTG浓度和温度对重组大肠杆菌发酵生产Tfu0883的影响,发现不添加IPTG和25°C恒温培养效果较好,发酵80 h培养基中pNPB水解酶酶活达130.5 U/ml。在该条件下发酵生产Tfu0883,周质空间有大量重组蛋白积累,跨外膜转运成为重组蛋白向培养基中分泌的限速步骤。通过添加膜透性增强剂和改变环境条件加速重组Tfu0883从周质空间向培养基中分泌。研究表明,在对数生长中期,添加100 mM甘氨酸、1 mM表面活性剂TDOC均可将酶活最高点从80 h提前至54 h;采取重组大肠杆菌在25°C发酵至24 h时将培养温度提高至37°C的变温策略对重组蛋白的分泌有促进作用,酶活最高点出现于62 h,比不变温的对照提前了18 h。4.重组Tfu0882、Tfu0883和F. solani pisi角质酶在水溶液中均以单体形式存在。重组Tfu0882、Tfu0883的最适温度为60°C,并具有良好的热稳定性;重组F. solani pisi角质酶的最适温度为40°C,热稳定性较差。三种角质酶的最适pH均为8.0,pH稳定范围为6.0-9.0。三种角质酶均能够水解可溶性酯、不溶性甘油三酯和聚酯,并倾向于水解短链底物,没有位置特异性。F. solani pisi角质酶对pNPB底物的亲和力最大,催化效率最高;F. solani pisi角质酶水解PET能力最强,Tfu0883次之,Tfu0882对PET仅有微弱水解。三种角质酶都没有界面活化现象,不需要二价金属离子作为辅助因子,Mn2+对三者有激活作用,Cr2+和Hg2+对三种角质酶有强烈抑制作用。Triton X-100和Tween 20抑制Tfu0882和Tfu0883的活性,对F. solani pisi角质酶无明显作用;SDS对三种角质酶均有竞争性抑制,Tfu0882抑制最弱;TDOC对F. solani pisi角质酶有明显激活作用。重组Tfu0882和Tfu0883在甲醇、乙醇等多种有机溶剂中具有良好的稳定性,F. solani pisi角质酶在有机溶剂中的稳定性较差。5.以Streptomyces exfoliates脂肪酶晶体结构为模板,通过SWISS-MODEL软件模拟得到Tfu0883和Tfu0882结构模型。模型显示,T. fusca角质酶具有典型的α/β水解酶结构,Tfu0883的活性中心由S170-H248-D216催化三角组成,Tfu0882的活性中心由S188- H266-D234催化三角组成。T. fusca角质酶活性中心上方没有盖子结构,活性中心暴露于溶剂中。角质酶基因Tfu0882和Tfu0883在基因组中处在相邻位置,并处于两个不同的操纵子中,受到不同的调控。Tfu0882和Tfu0883在水解角质过程中没有协同作用。在结构模拟的基础上进行理性分析,并成功构建了角质酶突变体Tfu0883-I218A、Tfu0883-W195A/F249A和Tfu0883-Q132A/T101A,催化性质研究表明,突变体对小分子底物的催化没有明显影响;突变体Tfu0883-I218A和Tfu0883-Q132A/T101A水解角质能力明显提高;突变体Tfu0883-Q132A/T101A水解PET聚酯的能力也得到明显提高。