第一部分青霉素致反复惊厥模型远期可塑性相关蛋白家族Plpprs和线粒体功能相关蛋白表达变化和相互作用目的:探讨青霉素致反复惊厥模型远期发育、神经行为、认知和海马形态损伤与海马和大脑皮层可塑性相关蛋白家族Plpprs、线粒体功能相关蛋白分子和锌离子转运体分子表达变化和相互作用。方法:200只雄性SD(日龄21天,P21)大鼠随机分成2组:Control组(n=80/每组),建模组(n=120/每组)。建模组建立青霉素致发育期反复惊厥性脑损伤模型:每只大鼠500万单位/kg剂量腹腔注射青霉素,隔日注射一次,共注射6次建模完成(P21-31)。根据入选标准获得RS组80只(n=80/每组)。Control组在与RS组处理相同时间腹腔注射相同剂量的生理盐水。隔日监测大鼠体重。分别在建模7天,14天,21天,28天后,监测神经反射发育,神经行为,学习记忆指标变化:Neo-Timm’s染色观察海马苔藓纤维发芽和杏仁核Timm着色;尼氏染色观察海马和杏仁核神经元细胞数量和形态;Real-Time RT-PCR检测海马可塑性相关蛋白家族Plpprs,线粒体功能相关蛋白的mRNA表达,同时还检测了锌离子通道蛋白ZnTs mRNA表达并分析可塑性相关蛋白家族Plpprs和线粒体功能相关蛋白白的mRNA表达的相关性;Western-Blot 检测海马和大脑皮层可塑性相关蛋 白家族 Plpprs 和线粒体功能相关蛋白的表达。结果:(1)体重:建模当天各时间点Control组与RS组体重均没有统计学差异,在建立青霉素致发育期反复惊厥性脑损伤模型后7天(P38,n=20/每组),14天(P45,n=20/每组),21天(P52,n=20/每组),RS组在第二次注射青霉素时体重开始显著低于Control组(P<0.05);28天(P59,n=20/每组)时间点的RS组在第三次注射青霉素时体重开始显著低于Control组(P<0.05);当RS组开始出现这种低体重状态均会一直持续到取脑组织当天;在建立青霉素致发育期反复惊厥性脑损伤模型后7天,14天,28天,三个时间点的RS组的日均体重增长率均显著低于Control组(P<0.05),末次青霉素注射后21天时间点的RS组的日均体重增长率低于Control组,但是没有统计学意义;(2)神经发育:在前肢悬吊试验中,RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点前肢悬吊反射时间均显著低于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05)。在负向趋地试验中,RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点负向趋地反射时间均显著高于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05)。在悬崖回避试验中,RS组在7天,21天,28天三个时间点悬崖回避反射时间均显著高于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05),RS组在14天时间点悬崖回避反射时间高于Control组,但是差异没有统计学意义。在平面翻正试验中,RS组在天时间点平面翻正反射时间显著高于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05),其余三个时间点的差异没有统计学意义;(3)神经行为:在旷场实验中,RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点水平穿越格子数均显著低于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05)。RS组在7天,21天,28天三个时间点修饰胡须的次数均显著高于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05),RS组在14天时间点修饰胡须的次数高于Control组,但是差异没有统计学意义。RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点双后肢着地站立的次数均显著低于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05);(4)学习记忆:在新异物识别实验中,RS组在14天21,21天,28天三个时间点认知指数均显著低于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05);RS组在7天时间点认知指数低于Control组,但是差异没有统计学意义;(5)Neo-Timm’s 染色:①海马区:RS组在21天,28天两个时间点CA3和DG区着色的Timm颗粒数量显著高于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05);RS组在7天和14天两个时间点CA3和DG区着色的Timm颗粒与Control组差异没有统计学意义;②杏仁核:通过对Neo-Timm’s染色中杏仁核区分析可见,RS组在21天,28天两个时间点杏仁核区着色光密度显著高于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05);RS组在7天和14天两个时间点杏仁核区着色光密度与Control组差异没有统计学意义;(6)尼氏染色:RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点海马CA1区,CA3区及杏仁核区神经元数量显著低于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05),且神经元结构紊乱,胞浆尼氏染色不均匀;(7)Real-Time RT-PCR:①可塑性相关蛋白家族Plpprs基因:青霉素处理使SD大鼠在28天时间点Plppr3,Plppr4,Plppr5 mRNA表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS组在其他时间点Plppr3,Plppr4,Plppr5 mRNA表达较Control组没有统计学意义。RS组7天,14天,21天,28天四个时间点Plpprl和Plppr2 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异;②锌离子通道蛋白ZnTs基因:青霉素处理使SD大鼠在28天时间点ZnTl mRNA表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS组在14天时间点ZnT1 mRNA表达较Control组升高,但是并没有统计学意义;RS组在7天,21天两个时间点ZnT1 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异。RS组在21天,28天两个时间点ZnT3 mRNA表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS组在7天,14天两个时间点ZnT3 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异。RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点ZnT6和ZnT7 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异:③线粒体功能相关基因:青霉素处理使SD大鼠在28天时间点Bnip3L和BAD mRNA表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);在7天,14天,21天三个时间点RS组Bnip3L和BAD mRNA表达较Control组升高,但是并没有统计学意义。在14天和28天时间点RS组低氧诱导因子HIF-1α和mTOR mRNA表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS组在7天和21天两个时间点低氧诱导因子HIF-1α和mTOR mRNA表达较Control组升高,但是并没有统计学意义。RS组在7天,14天,21天和28天四个时间点HDAC1,FOUNDC1和PARKIN mRNA表达均较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。RS组在21天和28天时间点sesn2 mRNA表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS组在7天和14天两个时间点Sesn2 mRNA表达较Control组升高,但是并没有统计学意义。RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点Bnip3,UCP2,P53,NF-κB,DRP1,E21F,Endog 和 Pink1 mRNA 表达与 Control 组相比并没有统计学上的差异;(8)相关性分析:将海马可塑性相关家族蛋白Plpprs和线粒体功能相关蛋白mRNA表达进行相关性分析,发现可塑性相关家族蛋白P1ppr1与P53,SENSN2和PARKIN mRNA表达呈显著性负相关,且具有统计学意义(P<0.05),与E21F mRNA表达呈显著性正相关,且具有统计学意义(P<0.05);可塑性相关家族蛋白P1ppr2与UCP2 mRNA表达呈显著性负相关,且具有统计学意义(P<0.05);可塑性相关家族蛋白P1ppr3与E21F mRNA表达呈显著性负相关,且具有统计学意义(P<a05),与Bnip3L,mTOR,HDAC1,BAD和FUNDC1 mRNA表达呈显著性正相关,且具有统计学意义(P<0.05);可塑性相关家族蛋白P1ppr4与Bnip3L mRNA表达呈显著性正相关,且具有统计学意义(P<0.05);可塑性相关家族蛋白P1ppr5与PINK1 mRNA表达呈显著性负相关,且具有统计学意义(P<0.05),与Bnip3L和HIF1αα mRNA表达呈显著性正相关,且具有统计学意义(P<0.05);以上结果显示可塑性相关家族蛋白和线粒体功能相关多个分子有相关性关系,在这些有相关性的分子mRNA表达中,P1ppr5和HIF1α mRNA表达相关性最高,相关系数达到0.8586,P<0.0001;(9)Western Blot:①可塑性相关蛋白Plpprs:在海马组织中,RS组在7天,14天,21天和28天四个时间点海马可塑性相关蛋白P1ppr1,P1ppr4和P1ppr5蛋白表达均较Contro1组显著升高,差异具有统计学意义(P<a05)。皮层,P1ppr1:RS组在14天时间点大脑皮层P1ppr1蛋白表达较Contro1组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RS组在21天和28天两个时间点大脑皮层P1ppr1蛋白表达较Contro1组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS组在7天时间点大脑皮层P1ppr1蛋白表达较Contro1组无统计学上的差异。P1ppr4:RS组在7天和14天两个时间点大脑皮层可塑性相关蛋白P1ppr4蛋白表达较Control组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RS组在28天时间点大脑皮层可塑性相关蛋白P1ppr4蛋白表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);P1ppr5:RS组在7天,14天,21天和28天四个时间点大脑皮层可塑性相关蛋白P1ppr5蛋白表达均较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);②线粒体功能相关蛋白:HIF-1α:RS组在7天,14天,21天和28天四个时间点海马低氧诱导因子HIF-1α蛋白表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS组在7天,14天和28天三个时间点大脑皮层低氧诱导因子HIF-1α蛋白表达均较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS组在21天时间点大脑皮层低氧诱导因子HIF-1α蛋白表达较Control组升高,但是并没有统计学意义。PGC-1α:RS组在7天,21天和28天三个时间点海马转录共激活因子PGC-天时间点海马转录共激活因子PGC-1α蛋白表达较Control组降低,但是并没有统计学意义。RS组在7天,14天,21天和28天四个时间点大脑皮层转录共激活因子PGC-1α蛋白表达均较Control组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。Sirt3:RS组在14天和28天时间点海马Sirt3蛋白表达较Control组降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RS组在7天和21天时间点海马Sirt3蛋白表达较Control组没有统计学上的差异。RS组在7天,14天和28天三个时间点大脑皮层Sirt3蛋白表达均较Control组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RS组在21天时间点大脑皮层Sirt3蛋白表达较Con1α蛋白表达均较Contro1组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RS组在14 trol组降低,但是并没有统计学意义。Prohibitin:RS组在14天,21天和28天三个时间点海马线粒体标记蛋白Prohibitin表达较Control组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RS组在7天时间点海马线粒体标记蛋白白 Prohibitin表达较Control组无统计学上的差异。RS组在7天,14天,21天和28天三个时间点大脑皮层线粒体标记蛋白Prohibitin表达均较Control组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:青霉素反复惊厥所致远期发育、神经行为、认知和海马形态损伤可能与海马和大脑皮层可塑性相关蛋白分子和线粒体功能相关蛋白分子分子表达变化和相互作用有关。第二部分 生酮饮食干预远期前脑可塑性相关蛋白分子和线粒体功能相关蛋白分子表达目的:探讨海马和大脑皮层可塑性相关蛋白分子、线粒体功能相关蛋白分子和锌离子转运体分子表达在生酮饮食对发育期惊厥性脑损伤神经保护中的作用。方法:100只SD(日龄21天,P21)大鼠随机分成2组:对照组(n=40/每组)和建模组(n=60/每组),建模组建立青霉素致发育期反复惊厥性脑损伤模型:每只大鼠500万单位/kg腹腔注射青霉素,隔日注射一次,共计注射6次建模完成(P21-31)。根据入选标准获得成功建模组40只(n=40/每组)。对照组在与建模组处理相同时间腹腔注射相同剂量的生理盐水。在建模完成后进一步将对照组随机分为Control组(n=20/每组)和KD组(n=20/每组),成功建模组随机分为RS组(n=20/每组),RS+KD组(n=20/每组)。建模完成后一日开始(P32),KD组和RS+KD组给予生酮饮食干预28天(P32-P59),Control组和RS组继续食用普通颗粒饲料,所有大鼠均不限制饮水,隔日监测大鼠体重。监测神经反射发育,神经行为,学习记忆指标变化;Neo-Timm’s染色观察海马苔藓纤维发芽和杏仁核Timm着色;尼氏染色观察海马和杏仁核神经元细胞数量和形态;高尔基染色观察神经元轴突长度,分级及棘突数量;Real-Time RT-PCR检测海马可塑性相关蛋白家族Plpprs,线粒体功能相关蛋白的mRNA表达,同时还检测了锌离子通道蛋白ZnTs mRNA表达;Western-Blot检测海马和大脑皮层可塑性相关蛋白家族Plpprs和线粒体功能相关蛋白的表达;EMSA检测海马和大脑皮层HIF-1α的转录活性。结果:(1)体重:四组体重在实验过程中总体差异具有统计学意义。在P21-P23四组体重均没有统计学差异,从P25开始四组体重开始出现差异,RS组和RS+KD组体重开始显著低于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05),这种差异持续到处死当天(P59),KD组体重从P35开始显著低于Control组,差异具有统计学意义,这种差异持续到P59,RS+KD组体重从P39开始显著低于RS组,差异具有统计学意义(P<0.05),这种差异持续到P59。在四组日均体重增长率的比较中,KD组,RS组和RS+KD组日均体重增长率均显著低于Control组,差异具有统计学意义(P<05),KD组和RS+KD组均显著低于RS组,差异具有统计学意义(P<0.05);(2)神经发育:在建立发育期反复惊厥模型28天后,在前肢悬吊试验中,RS组前肢悬吊反射时间显著低于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组前肢悬吊反射时间显著高于RS组,差异具有统计学意义(P<0.05);与Control组无显著差异,趋于正常。在负向趋地试验中,RS组负向趋地反射时间显著高于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组负向趋地反射时间显著低于RS组,差异具有统计学意义(P<0.05);与Control组无显著差异,趋于正常。在悬崖回避试验中,RS组悬崖回避反射时间均显著高于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05),RS+KD组悬崖回避反射反射时间显著低于RS组,差异具有统计学意义(P<0.05);与Control组无显著差异,趋于正常。在平面翻正试验中,RS组平面翻正反射时间高于Control组,但差异并没有有统计学意义;(3)学习记忆:在新异物识别实验中,建立发育期反复惊厥模型28天后,RS组认知指数显著低于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组认知指数显著高于RS组,差异具有统计学意义(P<0.05):与Control组无显著差异,趋于正常:(4)血糖,血酮水平:在建立发育期反复惊厥模型28天后,KD组和RS+KD组血糖水平显著低于Control组和RS组,差异具有统计学意义(P<0.05);RS组与Control组血糖水平无显著差异。KD组和RS+KD组血酮水平显著高于Control组和RS组,差异具有统计学意义(P<0.05):RS组与Control组血酮水平无显著差异;(5)Neo-Timm’s 染色:通过对Neo-Timm’s染色中海马区分析可见,RS组CA3和DG区着色的Timm颗粒数量显著高于Control组和KD组,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组CA3和DG区着色的Timm颗粒数量显著低于RS组,差异具有显著的统计学意义(P<0.05),与Control组和KD组差异没有统计学意义,趋于正常。通过对Neo-Timm’s染色中杏仁核区分析可见,RS组和RS+KD组杏仁核Timm着色的光密度显著高于Control组和KD组,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组杏仁核Timm着色的光密度值显著低于RS组,差异具有显著的统计学意义(P<0.05);(6)尼氏染色:在对海马区尼氏染色中RS组在海马CA1区,CA3区神经元数量显著低于Control组和KD组,差异具有统计学意义(P<0.05),且神经元结构紊乱,胞浆尼氏染色不均匀;RS+KD组在海马CA1区,CA3区神经元数量显著高于RS组,差异具有统计学意义(P<0.05),与Control组差异没有统计学意义,趋于正常。在对杏仁核区尼氏染色中RS组在杏仁核区神经元数量显著低于Control组和KD组,差异具有统计学意义(P<0.05),且神经元结构紊乱,胞浆尼氏染色不均匀;RS+KD组在杏仁核区神经元数量显著高于RS组,差异具有统计学意义(P<0.05),与Control组差异没有统计学意义,趋于正常;(7)高尔基染色:本论文使用高尔基染色及Sholl分析来分析大脑皮层神经元复杂性,结果发现KD组,RS组和RS+KD组神经元突起分支等级显著低于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05),RS+KD组神经元突起分支等级显著高于RS组,差异具有统计学意义(P<0.05)。在对大脑皮层神经元突起长度的分析中我们发现,RS组神经元突起长度显著低于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05),RS+KD组神经元突起长度高于RS组,但是差异没有统计学意义。在对大脑皮层神经元树突上的棘突数量的分析中我们发现:RS组神经元棘突数量显著低于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05),生酮饮食可以显著改善这种缺陷,使RS+KD组神经元棘突数量显著高于RS组,差异具有统计学意义(P<0.05),趋于正常;(8)Real-Time RT-PCR:①可塑性相关蛋白Plpprs基因:RS组Plppr3,Plppr4,Plppr5 mRNA表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组Plppr3,Plppr4,Plppr5 mRNA表达较RS组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与Control组相比并没有统计学上的差异,趋于正常。RS组可塑性相关蛋白Plppr1和Plppr2mRNA表达较Control组升高,但是并没有统计学意义。RS+KD组可塑性相关蛋白Plppr1mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异;②锌离子通道蛋白ZnTs基因:RS组ZnT1 mRNA表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组ZnT1 mRNA表达较RS组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组ZnT1 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异,趋于正常。RS组ZnT3mRNA表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。RS组ZnT6和ZnT7 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异;③线粒体功能相关基因:RS 组 Bnip3L,HIF-1α,HDAC1,mTOR 和 ParkinmRNA表达均较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组Bnip3L,HIF-1α,HDAC1,mTOR和ParkinmRNA表达均较RS组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD 组 Bnip3L,HIF-1α,HDAC1,mTOR 和 ParkinmRNA 表达与Control组相比并没有统计学上的差异,趋于正常。RS组Bnip3,UCP2,P53,NF-κB,DRP1,E21F,Endog和Pink1 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异;(9)Western Blot:①Plppr1:在海马组织中,RS组海马Plppr1蛋白表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组海马Plppr1蛋白表达较RS组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组海马Plppr1蛋白表达与Control组没有统计学显著性差异,趋于正常。在大脑皮层组织中,RS组大脑皮层Plppr1蛋白表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<O.05);RS+KD组大脑皮层Plppr1蛋白表达较RS组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组大脑皮层Plppr1蛋白表达与Control组没有统计学显著性差异,趋于正常;②Plppr5:在海马组织中,KD组,RS组和RS+KD组海马Plppr5蛋白表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组海马Plppr5蛋白表达较RS组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。在大脑皮层组织中,RS组和RS+KD组皮层Plppr5蛋白表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组皮层Plppr5蛋白表达较RS组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);③线粒体功能相关蛋白:HIF-1α:在海马组织中,KD组,RS组和RS+KD组海马HIF-1 α表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组海马HIF-1α蛋白表达较RS组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。在大脑皮层组织中,RS组HIF-1α蛋白表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组大脑皮层HIF-1α蛋白表达较RS组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),RS+KD组大脑皮层HIF-1α蛋白表达与Control组相比并没有统计学上的差异,趋于正常;PGC-1α:在海马组织中,RS组PGC-1α蛋白表达较Control组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);KD组和RS+KD组海马PGC-1α蛋白表达较Control组和RS组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。在大脑皮层组织中,KD组,RS组和RS+KD组PGC-1α蛋白表达较Control组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组大脑皮层PGC-1α蛋白表达较RS组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);Sirt3:在海马组织中,RS组Sirt3蛋白表达较Control组和KD组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组海马Sirt3蛋白表达较RS组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组海马Sirt3蛋白表达与Control组相比并没有统计学上的差异,趋于正常。在大脑皮层组织中,RS组RS+KD组大脑皮层Sirt3蛋白表达较Control组和KD组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组大脑皮层Sirt3蛋白表达较RS组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);p-AMPK:在海马组织中,RS组海马AMPK蛋白磷酸化水平较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。RS+KD组海马AMPK蛋白磷酸化水平较RS组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组海马AMPK蛋白磷酸化水平与Control组没有统计学显著性差异,趋于正常。在大脑皮层组织中,KD组和RS组大脑皮层AMPK蛋白磷酸化水平较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组大脑皮层AMPK蛋白磷酸化水平较RS组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组大脑皮层AMPK蛋白磷酸化水平与Control组没有统计学显著性差异,趋于正常;Bnip3L:在海马组织中,RS组海马LC3受体Bnip3L蛋白表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组海马LC3受体Bnip3L蛋白表达较RS组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组海马Bnip3L蛋白表达与Control组没有统计学显著性差异,趋于正常。在大脑皮层组织中,RS组大脑皮层LC3受体Bnip3L蛋白表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组大脑皮层LC3受体Bnip3L蛋白表达较RS组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组大脑皮层Bnip3L蛋白表达与Control组没有统计学显著性差异,趋于正常;Prohibitin:在海马组织中,KD组和RS组海马线粒体标记蛋白Prohibitin表达较Control组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组海马线粒体标记蛋白Prohibitin表达较RS组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组海马线粒体标记蛋白Prohibitiin表达与Control组没有统计学显著性差异,趋于正常。在大脑皮层组织中,KD组和RS组大脑皮层线粒体标记蛋白Prohibitin表达较Control组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组大脑皮层线粒体标记蛋白Prohibitin表达较RS组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);RS+KD组大脑皮层线粒体标记蛋白Prohibitin表达与Control组没有统计学显著性差异,趋于正常。(10)EMSA:KD组,RS组和RS+KD组海马和皮层HIF-1α的转录活性均较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论::生酮饮食对发育期惊厥性脑损伤的神经保护作用可能通过调节海马和大脑皮层可塑性相关蛋白分子、线粒体功能相关蛋白分子和锌离子转运体分子表达实现。第三部分酮体在离体细胞模型中对谷氨酸毒性的保护作用及Plppr5神经保护作用义(P<0.05);β-HB共处理显著降低了 Glutamate处理后AMPK磷酸化,差异具有的机制研究目的:探讨酮体在离体细胞模型中对谷氨酸毒性的保护作用及Plppr5神经保护作用的机制方法:第一节采用小鼠海马神经元细胞株HT22,按照处理不同分为四组:Control组、β-HB组、Glutamate组和Glutamate+β-HB组。每组定义及处理如下:Control组:空白对照组,细胞不做处理;β-HB组:酮体β-HB(β-羟丁酸,无血清培养基配制,PH7.4)处理细胞 24h(5mmol/L);Glutamate 组:谷氨酸处理细胞 24h(5mmol/L,无血清培养基配制,PH7.4);Glutamate+β-HB组:谷氨酸(5mmol/L)和β-HB(5mmol/L)共同处理细胞24h。通过CCK8法测各组细胞存活率,酶标仪检测各组乳酸脱氢酶LDH释放和超氧化物歧化酶SOD活性,流式仪检测各组细胞线粒体膜电位,活性氧ROS和线粒体数量,激光共聚焦显微镜检测各组细胞线粒体ROS,活性线粒体比例和线粒体自噬活性,Western-Blot检测低氧诱导因子HIF1α,可塑性相关蛋白Plppr5,pAMPK,线粒体自噬LC3受体Bnip3L,转录共激活因子PGC-1α,人类沉默信息调节因子2相关酶家族蛋白Sirt3和线粒体标记蛋白Prohibitin表达。第二节按照处理不同分为四组:shControl组、shPlppr5组、shControl+Glutamate组、shPlppr5+Glutamate组,各组定义及处理如下:shControl组:空载慢病毒侵染细胞72小时后更换为正常培养基继续培养24h;shPlppr5组:shPlppr5慢病毒侵染细胞72小时后更换为正常培养基继续培养24h;shControl+Glutamate组:空载慢病毒侵染细胞 72 小时后,谷氨酸(5mmol/L)处理 24h;shPlppr5+Glutamate 组:shPlppr5慢病毒侵染细胞72小时后,谷氨酸(5mmol/L)处理24h。通过CCK8法测各组细胞存活率,酶标仪检测各组LDH释放和SOD活性,流式仪检测各组细胞线粒体膜电位,ROS和线粒体数量,激光共聚焦显微镜检测各组细胞线粒体ROS,活性线粒体比例和线粒体自噬水平,Western-Blot检测低氧诱导因子HIF1α,可塑性相关蛋白Plppr5,pAMPK,线粒体自噬受体Bnip3L,转录共激活因子PGC-1α,人类沉默信息调节因子2相关酶家族蛋白Sirt3和线粒体标记蛋白Prohibitin表达。结果:第一节(1)细胞生长:使用CCK8检测各组细胞存活率,发现Glutamate组细胞存活率显著低于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05);β-HB共处理明显提高了 Glutamate处理后细胞的存活率,差异具有统计学意义(P<0.05);(2)线粒体氧化应激指标:①使用LDH试剂盒检测各组细胞LDH释放量,发现Glutamate组细胞LDH释放量显著高于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05);β-HB共处理明显抑制了 Glutamate处理后细胞LDH释放,差异具有统计学意义(P<0.05):②使用SOD活性试剂盒检测各组细胞SOD活性,发现Glutamate组细胞SOD活性显著低于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05);β-HB共处理明显提高了Glutamate处理后细胞的SOD活性,差异具有统计学意义(P<0.05);③使用流式细胞仪检测各组细胞Mitotraker Green探针和MitoSOX探针荧光强度,发现Glutamate组细胞Mitotraker Green和MitoSOX荧光双阳性细胞比例显著高于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05);β-HB共处理明显降低了 Glutamate处理后细胞的Mitotraker Green和MitoSOX荧光双阳性细胞比例,差异具有统计学意义(P<0.05);使用激光共聚焦显微镜检测Mitotraker Green探针和MitoSOX探针荧光时,我们发现Glutamate组细胞MitoSOX荧光密度显著高于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05);β-HB共处理明显降低了 Glutamate处理后细胞的MitoSOX荧光密度,差异具有统计学意义(P<0.05);(3)线粒体功能指标:①使用流式细胞仪检测各组细胞JC-1,发现Glutamate组线粒体膜电位显著低于 Control组,差异具有统计学意义(P<0.05);β-HB共处理明显升高了 Glutamate处理后细胞的膜电位,差异具有统计学意义(P<0.05);②使用流式细胞仪检测各组细胞Mitotraker Green探针和Mitotraker Red探针荧光强度,发现Glutamate组细胞活性线粒体比例显著低于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05);β-HB共处理显著增加了 Glutamate处理后细胞活性线粒体比例,差异具有统计学意义(P<0.05);使用激光共聚焦显微镜检测Mitotraker Green探针和Mitotraker Red探针荧光时,我们发现Glutamate组细胞Mitotraker Red荧光密度显著低于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05);β-HB共处理明显增加了 Glutamate处理后细胞的Mitotraker Red荧光密度,差异具有统计学意义(P<0.05):(4)线粒体自噬:使用激光共聚焦显微镜检测Mtphagy Dye和Lyso Dye探针时,我们发现Glutamate组细胞线粒体自噬活性显著高于Control组,差异具有统计学意义(P<0.05);β-HB共处理明显降低了 Glutamate处理后细胞的线粒体自噬活性,差异具有统计学意义(P<0.05);(5)Western Blot:①Plppr5:Glutamate组可塑性相关蛋白Plppr5蛋白表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);β-HB共处理显著降低了Glutamate处理后可塑性相关蛋白Plppr5蛋白表达,差异具有统计学意义(P<0.05);②线粒体功能相关蛋白:HIF1α:Glutamate组低氧诱导因子HIF-1α蛋白表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);β-HB共处理显著降低了Glutamate处理后低氧诱导因子HIF-1α蛋白表达,差异具有统计学意义(P<0.05);pAMPK:Glutamate组AMPK磷酸化水平较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);β-HB共处理显著降低了 Glutamate处理后AMPK磷酸化,差异具有统计学意义(P<0.05);Bnip3L:Glutamate组线粒体LC3受体Bnip3L蛋白表达较Control组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);β-HB共处理显著降低了Glutamate处理后线粒体LC3受体Bnip3L蛋白表达,差异具有统计学意义(P<0.05);PGC1α:Glutamate组转录共激活因子PGC-1α蛋白表达较Control组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);β-HB共处理显著增加了 Glutamate处理后转录共激活因子PGC-lα蛋白表达,差异具有统计学意义(P<0.05);Sirt3:Glutamate组Sirt3蛋白表达较Control组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);β-HB共处理显著增加了 Glutamate处理后Sirt3蛋白表达,差异具有统计学意义(P<0.05);Prohibitin:Glutamate组线粒体标记蛋白Prohibitin表达较Control组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);β-HB共处理显著增加了 Glutamate处理后线粒体标记蛋白Prohibitin表达,差异具有统计学意义(P<0.05);第二节(1)细胞生长:使用CCK8检测各组细胞存活率,发现shPlppr5组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组细胞存活率均显著低于 ShControl组,差异具有统计学意义(P<0.05);(2)线粒体氧化应激指标:①使用LDH试剂盒检测各组细胞LDH释放量,发现 shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组细胞 LDH 释放量显著高于ShControl组,差异具有统计学意义(P<0.05);Plppr5基因沉默使Glutamate处理后细胞LDH释放增加,但差异没有统计学意义;②使用SOD活性试剂盒检测各组细胞SOD活性,发现ShControl+Glutamate组和ShPlppr5+Glutamate组细胞SOD活性均显著低于ShControl组,差异具有统计学意义(P<0.05);可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默降低了 Glutamate处理后细胞的SOD活性,但差异不具有统计学意义;③使用流式细胞仪检测各组细胞Mitotraker Green探针和MitoSOX探针荧光强度,发现 shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组细胞 Mitotraker Green和MitoSOX荧光双阳性细胞比例显著高于ShControl组,差异具有统计学意义(P<0.05);可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默明显增加了 Glutamate处理后细胞的Mitotraker Green和MitoSOX荧光双阳性细胞比例,差异具有统计学意义(P<0.05);使用激光共聚焦显微镜检测Mitotraker Green探针和MitoSOX探针荧光时,我们发现shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组细胞 MitoSOX 荧光密度显著高于ShControl组,差异具有统计学意义(P<0.05);可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默明显增加了 Glutamate处理后细胞的MitoSOX荧光密度,差异具有统计学意义;(3)线粒体功能指标:①使用流式细胞仪检测各组细胞JC-1,发现shPlppr5组,ShControl+Glutamate组和ShPlppr5+Glutamate组细胞线粒体膜电位显著低于ShControl组,差异具有统计学意义(P<0.05);可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默明显降低了 Glutamate处理后细胞的线粒体膜电位,差异具有统计学意义(P<0.05);②使用流式细胞仪检测各组细胞Mitotraker Green探针和Mitotraker Red探针荧光强度,发现 shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组细胞Mitotraker Green和Mitotraker Red焚光双阳性细胞比例显著低于ShControl组,差异具有统计学意义(P<0.05);可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默显著降低了 Glutamate处理后细胞Mitotraker Green和Mitotraker Red荧光双阳性细胞比例,差异具有统计学意义(P<0.05);使用激光共聚焦显微镜检测Mitotraker Green探针和Mitotraker Red 探针荧光时,我们发现 shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate组细胞Mitotraker Red荧光密度显著低于ShControl组,差异具有统计学意义(P<05);可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默降低了 Glutamate处理后细胞的Mitotraker Red荧光密度,但差异并没有统计学意义;(4)线粒体自噬:使用激光共聚焦显微镜检测Mtphagy Dye和Lyso Dye探针时,我们发现 shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组细胞线粒体自噬活性显著高ShControl组,差异具有统计学意义(P<0.05);可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默明显增加了 Glutamate处理后细胞的线粒体自噬活性,差异具有统计学意义(P<0.05);(5)Western Blot:①Plppr5:Plppr5 基因沉默显著降低了 HT22 细胞 Plppr5 蛋白表达,差异具有统计学意义(P<0.05);谷氨酸显著增加了 HT22细胞Plppr5蛋白表达,差异具有统计学意义(P<0.05);Plppr5基因沉默后谷氨酸处理不能增加Plppr5蛋白表达,差异具有统计学意义(P<0.05);②线粒体功能相关蛋白:HIF-1α:shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate组低氧诱导因子HIF-1α表达显著高于ShControl组,差异具有统计学意义(P<0.05),ShPlppr5+Glutamate组低氧诱导因子HIF-1α表达显著低于ShControl+Glutamate 组,差异具有统计学意义(P<0.05);p-AMPK:shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组 AMPK 磷酸化水平较 ShControl 组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05),ShPlppr5+Glutamate组AMPK磷酸化水平较ShControl+Glutamate组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);BNIP3L:shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组线粒体 LC3 受体 BNIP3L蛋白表达较ShControl组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);PGC-1α:shPlppr5组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组转录共激活因子 PGC-1α 蛋白表达较ShControl组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);Sirt3:shPlppr5组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组 Sirt3 蛋白表达较 ShControl 组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);Plppr5基因沉默显著降低了 Glutamate处理后Sirt3蛋白表达,差异具有统计学意义(P<0.05);Prohibitin:shPlppr5组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组线粒体标记蛋白 Prohibitin 表达较ShControl组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);Plppr5基因沉默显著降低了 Glutamate处理后Prohibitin表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:在离体神经细胞兴奋毒性损伤模型中,Plppr5通过调节线粒体功能发挥酮体的神经保护作用。